从不同的脂肪库分离和鉴定血管内皮细胞，用于下游应用

该协议将允许研究人员解剖感兴趣的动脉并分离血管细胞以进行广泛的功能测试。研究人员可以研究不同的血管床和细胞类型，以扩展血管细胞生物学和血管功能障碍机制的知识。该方法最适用于研究基础血管细胞生物学以及疾病动物模型中血管细胞功能障碍的研究人员。

应特别注意优化消化方案，特别是当感兴趣的血管床与此处介绍的血管床不同时。首先，使用解剖针固定鼠标，并用70%乙醇喷洒腹面。用镊子将皮肤抬起生殖器正上方，并在皮肤上做一个大约两毫米的小切口。

将剪刀的尖端插入切口部位，并从初始切口开始做一个四到五厘米长的中线切口，并颅骨解剖到胸骨底部。从前肢正下方的中线横向切开一厘米的切口。在后肢和生殖器之间做一个一厘米的对角线切口。

沿着中线皮肤切口做小切口，剥去相关的结缔组织，露出皮下脂肪库。识别 C 形皮下脂肪组织和垂直于腹腔的动脉或静脉。从靠近生殖器的C形底部开始，轻轻抓住脂肪组织，露出结缔组织。

在结缔组织中做小切口，将脂肪与皮肤分离，并避免干扰暴露的脉管系统。继续解剖结缔组织，直到皮下脂肪组织可以完整切除。小心地将暴露的动脉与周围的结缔组织分开。

将分离的皮下脂肪储存在冰上的HEPES缓冲液中。对剩余的后皮下脂肪库重复夹层。要隔离肠系膜脂肪库，请使用格雷夫镊子将薄腹腔壁抬起膀胱上方，并使用直剪刀做一个小切口。

慢慢提起腹膜腔壁，将直虹膜剪刀插入切口部位。从膀胱到胸骨做一个四到五厘米的切口。然后做两个一厘米的水平切口，用直虹膜剪刀从中线横向延伸到后肢上方和前肢下方。

使用格雷夫镊子剥离腹部肌肉组织并暴露腹膜内脏。用一对五号镊子将肠子从内脏腔中取出，露出肠系膜脂肪。使用弯曲的剪刀和五号镊子沿着结肠分离脂肪，从盲肠开始到结肠从视野下降的地方。

然后，将脂肪沿小肠分离到胰腺。切除胰腺的一小部分以完全隔离肠系膜脂肪。将分离的肠系膜脂肪储存在冰上的HEPES缓冲液中。

为了分离动脉，首先将脂肪组织转移到含有10毫升冷HEPES缓冲液的解剖盘中。在体视显微镜下，定位皮下脂肪组织以暴露动脉静脉对。定位内脏脂肪组织以暴露花椰菜形状和相应的动脉静脉对。

使用55号镊子小心地从动脉中取出实质脂肪。一次去除小块脂肪，而不会损坏感兴趣的脉管系统。继续治疗，直到动脉完全没有实质脂肪组织。

使用五号镊子将清洁的动脉转移到带有新鲜HEPES缓冲液的新管中，并保持在冰上直到准备好消化。首先，将分散酶和弹性蛋白酶各一毫克加入两毫升微量离心管中。加入两毫升解离溶液，涡旋，在37摄氏度下孵育直至完全溶解。

使用五号镊子将清洁的动脉转移到相应的样品管中。将试管在 37 摄氏度下孵育一小时，每 10 至 15 分钟倒置轻轻搅拌一次。同时，将每个样品一毫克的胶原酶添加到新管中。

孵育后，让动脉沉淀在管的底部，并将500微升的缓冲液从顶部转移到含有胶原酶的管中。涡旋并将该溶液返回到相应的样品管中。将样品在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。

确保在摇动样品管时动脉分离成碎片。使用玻璃移液管，用力研磨消化的组织 10 到 15 次，以机械方式解离细胞。将消化的样品通过70微米细胞过滤器或流式细胞术管过滤器以获得单细胞悬液。

离心单细胞悬液并除去上清液。将细胞沉淀重新悬浮在含有5%BSA的一毫升PBS中30分钟。加入一微升细胞活力染色剂，在黑暗中孵育30分钟。

离心细胞悬液并将细胞沉淀重新悬浮在含有1%BSA的200微升PBS中。加入与CD31和CD45偶联的一抗，并在冰箱的摇杆上孵育15分钟。通过将一毫升含有1%BSA的PBS直接添加到细胞悬液中来洗涤细胞。

离心细胞悬液并将沉淀重新悬浮在200微升含有0.1%BSA的1%甲醛中。用铝箔盖住试管并存放在冰箱中，直到准备好进行流式细胞术。从消化的皮下脂肪动脉获得的细胞制剂用于使用流式细胞术鉴定内皮细胞群。

CD31阳性CD45阴性细胞被鉴定为内皮细胞。细胞活力染色仅允许鉴定那些在固定前在分离和消化方案中存活下来的活细胞。为了鉴定不同脂肪库脉管系统的膜蛋白表达和内皮细胞的差异，对分离的细胞进行脂肪酸转位酶CD36的探测。

在皮下和肠系膜脂肪中鉴定出CD36阳性内皮细胞。CD36表达以及皮下和肠系膜内皮细胞的定量显示，表达CD36的内皮细胞百分比和CD36表达强度在皮下内皮细胞中均更大。仔细解剖、识别和清洁动脉至关重要。

最重要的是，消化方案应为下游应用产生足够的活细胞产量。按照此过程，分离的细胞群可用于包括但不限于电生理学、分子分析和生成用于体外药物筛选的原代细胞系等应用。