该协议允许在平面方向上分析原始心内膜。我们可以分析心内膜细胞的分布，其他禁令的各向异性，并描述瓣膜发育过程中单个心内膜细胞的形状。与经典组织切片相比，内瓣膜再生区域的面部成像允许分析完整胚胎瓣膜发育过程中平面细胞极性和心内膜细胞的动力学。
该方法可用于加深心脏发育过程中平面细胞极性的知识。首先将从安乐死的怀孕小鼠中切除的子宫放入含有冰冷PBT的培养皿中。使用细镊子在解剖显微镜下从子宫中取出单个蜕膜。
使用细镊子，在蜕膜的白色部分切开一个切口，这是胚胎所在的位置。轻轻地将其取出，避免拉扯，并使用P-1000将胚胎转移到带有新鲜PBT的新培养皿中，尖端被切断，留下足够大的直径以使胚胎通过而不会破裂。对于基因分型，取一小块约0.5平方毫米的卵黄囊或从后端取一块尾巴，向头部计数5至10个体细胞，并在100毫升适当的缓冲液中消化。
在通风橱下，将胚胎转移到 4 摄氏度的两毫升微量离心管中的冰冷 4% PFA 中。将胚胎固定在章动器上，从两小时到四摄氏度过夜。在通风橱下，从微量离心管中取出4%PFA固定剂，不要接触胚胎。
将 PFA 丢弃在适当的容器中。在室温下在冷PBT中洗涤胚胎5次10分钟。使用细镊子取出心脏并将其转移到带有新鲜PBT的新1.5毫升微量离心管中。
用PBS Triton代替PBT，并在室温下在轨道振荡器上洗涤样品三次，每次五分钟。用含有PBS Triton和10%热灭活牛血清的封闭溶液替换PBS Triton。在轨道摇床上以四摄氏度孵育两小时至过夜。
用含有所需浓度的一抗的封闭溶液替换封闭溶液。在四摄氏度的轨道摇床上孵育过夜。在 4 摄氏度下孵育过夜后，将样品在室温下在轨道摇床上孵育 1.5 小时。
此步骤对于提高信噪比至关重要。取出一抗溶液并将其保持在 4 摄氏度，未来最多进行三次实验。加入叠氮化钠至终浓度为0.02%，以获得最佳保存效果。
然后，用PBS Triton清洗胚胎三次，每次三分钟。用PBS Triton清洗胚胎三次30分钟，并将它们保持在4摄氏度的轨道振荡器上。最后一次洗涤后，加入一毫升含有荧光偶联二抗的封闭溶液，以对抗一抗宿主物种。
然后将DAPI添加到溶液中，并将胚胎在4摄氏度的轨道振荡器上孵育过夜。在4摄氏度下孵育过夜后，将胚胎在室温下在轨道振荡器上孵育1.5小时。此步骤对于提高信噪比至关重要。
重复文本手稿中提到的PBS Triton清洗步骤。将心脏放在含有PBS的35毫米培养皿上。使用钨丝和细镊子，隔离房室管或流出道并纵向切割。
准备盖玻片、载玻片、镊子、带有适当吸头的 P-200 移液器、纸巾和任何基于甘油的水性封片剂，用于无 DAPI 的荧光。将两条胶带粘在相隔0.3至0.6厘米的载玻片上，以创建一个3D房间空间，使样品能够保持其原始形状而不会挤压它们。然后，使用大约 20 微升缓冲液，使用切割的 P-200 移液器吸头小心地将样品滴到胶带条之间的载玻片上。
使用解剖显微镜提高精度。使用细镊子，将样品放在心内膜朝上，心肌朝下放在载玻片上。用纸巾去除多余的PBS，避免接触样品。
然后，在室温下将样品干燥一到两分钟，使样品粘在载玻片上。向组织中加入40微升水性封片剂。将盖玻片放在两张胶带上，然后用针或镊子将其缓慢地放到纸巾上。
避免产生气泡。在盖玻片的每个顶点上用一滴指甲油密封盖玻片。指甲油干燥后，使用吸水纸巾清洁盖玻片侧面多余的镶片介质。
避免移动盖玻片。沿着盖玻片边缘添加指甲油以完全密封，防止安装介质蒸发。使用正置或倒置共聚焦显微镜，以 10 倍放大倍率拍摄图像以获得一般视图，以 63 倍放大倍率拍摄图像以获得详细图像。
在瓣膜形成过程中以细胞分辨率分析心内膜的细胞形状。在心内膜中表达GFP的单个细胞或几个细胞的克隆。GFP表达和与VE-钙粘蛋白亚细胞定位的组合是研究AJ动力学与丝状伪足形成和前EMT细胞之间关系的有效方法，因为这些细胞在AJ溶解时会产生膜突起。
心内膜中VE-钙粘蛋白染色强度的差异表明在瓣膜前阶段房室管的胚胎心内膜中存在各向异性收缩性。整个心脏在E8.5和E9.5处用VE-钙粘蛋白抗体染色。在E8.5时，房室管心内膜倾向于具有稳定的上皮组织，未检测到由四个以上细胞形成的顶点。
在E9.5处，观察到多达六个细胞的顶点形成玫瑰花状结构，类似于先前描述的上皮细胞组织经历活性细胞重排，表明房室管心内膜在瓣膜发育过程中正在经历动态细胞重排。学习曲线是成为这种技术专家所必需的。此外，强烈建议使用主权镊子和钨丝。
今天，瓣膜前心内膜的可视化仅限于横截面。我们的方法提供了从平面角度研究胚胎瓣膜心内膜行为的可能性。
