利用线性DNA模板从核酸外切酶缺陷细胞提取物中合成无细胞蛋白

该方案非常重要，因为它可以在无细胞蛋白质合成系统中快速、简单和直接地使用线性DNA模板，甚至可以从天然大肠杆菌参数中使用。主要优点是通过避免克隆、线性 DNA 末端的化学修饰以及伽马或气 DNA 等保护性补充剂来节省时间。由于正在为感兴趣的不同生物体开发自我报告的合成提取物，我们的方法提供了一种通过使用线性DNA来加速这些提取物原型设计的方法。

首先，将菌株 BL21 Rosetta-2 delta recBCD 从零下 80 摄氏度甘油原液划到含有每毫升 10 微克氯霉素的 2x YTP 琼脂平板上，并在 37 摄氏度下孵育过夜。然后，将琼脂平板中的单个菌落接种到略多于 40 毫升的 2x YTP 中，补充有每毫升 10 微克氯霉素，并在 37 摄氏度下以 200 RPM 振荡孵育过夜。接下来，通过将过夜培养物稀释 100 倍到含有每毫升 10 微克氯霉素的新鲜 2x YTP 培养基中来制作亚培养物。

将四升培养基分成四个单独的烧瓶。在 37 摄氏度、200 RPM 下孵育约 3 到 4 小时，以达到 1.5 至 2.0 的光密度。将培养物放在冰上，在4摄氏度下以5， 000g离心细胞12分钟，然后通过倾析丢弃上清液。

然后，用DTT将细胞沉淀重悬于800毫升冷藏S30A中。再次，如前所述，如前所述，在 5， 000 G 下旋转细胞 12 分钟，并通过倾析丢弃上清液。将细胞沉淀重悬于160毫升带有DTT的冷藏S30A中后，将细胞转移到冷藏和预先称重的50毫升管中。

在 2000 G 下将细胞在 4 摄氏度下旋转 8 分钟，然后通过倾析丢弃上清液。同样，在4摄氏度下以2000 G旋转细胞四分钟，然后使用移液管小心地除去剩余的上清液。然后，重新测量管的重量以计算细胞沉淀的重量，并将细胞沉淀保持在零下80摄氏度。

从零下80摄氏度取细胞沉淀后，在冰上解冻一到两个小时，然后将细胞沉淀重悬于0.9毫升S30A中，每克细胞沉淀重量使用DTT缓冲液。然后，缓慢移液以重悬细胞，尽可能避免顶部泡沫。将一毫升等分试样的重悬细胞放入 1.5 毫升微管中，并将它们放在冰上或 4 摄氏度的预冷块中。

接下来，在超声仪中以20%振幅的设置对每个管进行超声处理三个周期，并在4摄氏度下以12， 000 G旋转裂解物10分钟。用移液管收集上清液后，转移到50毫升管中。将细胞裂解物在 37 摄氏度下以 200 RPM 搅拌孵育 80 分钟。

旋转裂解物并将上清液收集在预冷的 1.5 毫升微管中后，在预冷的 PCR 8 条管中等分 30 微升，同时将所有管保持在冰上。将裂解物等分试样在干冰上快速冷冻，并在零下80摄氏度下储存。按照手稿中所述的缓冲液制备选项卡制备预混液。

对于10.5微升的反应体积，加入1.05微升不同的Mg-谷氨酸原液浓度和9.45微升预混液并轻轻混合。将上述反应的10微升移液到384孔的方形底部微孔板中，并使用粘性板密封盖住它。通过用酶标仪定期记录荧光数据，在30摄氏度下孵育8小时，以每分钟307个周期连续振荡轨道振荡，将基因表达测量为荧光输出。

在确定在终点产生最高荧光值的Mg-谷氨酸浓度后，继续进行K-谷氨酸校准。运行实验并从测试的K-谷氨酸浓度中鉴定出最高的荧光值，从而确定该裂解物的Mg-谷氨酸和K-谷氨酸的最佳缓冲液组成。一旦确定了Mg-谷氨酸和K-谷氨酸值，根据获得的批次体积制备优化缓冲液组合物的储备管。

计算所需的缓冲管数量后，每管等分 38 微升并储存在零下 80 摄氏度。首先，标记一个 1.5 毫升的微管，以获得最佳预混液制备。加入正确体积的缓冲液和裂解物并轻轻混合。

然后，首先移液DNA样品，然后是无核酸酶水，最后是最佳预混液。在加入酶标仪之前，用移液器轻轻混合无细胞反应，避免任何气泡。在酶标仪中设置反应后，动力学运行定期记录荧光数据，在30摄氏度下孵育8小时，以每分钟307个循环的速度连续振荡轨道。

校准裂解物后，线性和质粒DNA提取物的Mg-谷氨酸最佳浓度相似，为8毫摩尔。然而，质粒DNA的最佳K-谷氨酸浓度为140毫摩尔，而线性DNA的最佳K-谷氨酸浓度为20毫摩尔。校准步骤后，比较野生型、δ recB和δrecBCD提取物中线性和质粒DNA之间的GFP表达水平。

线性DNA的GFP表达分别达到δrecB和δrecBCD菌株提取物中质粒DNA表达的102%和138%。协议中最重要的事情是细胞的超声裂解和线性和质粒DNA的缓冲液校准步骤，特别是在使用天然参数时。该技术将有助于加快无细胞系统中生物设计的测试，例如，生物传感器，酶和途径的筛选，或合成遗传回路的原型设计。