一种基于四唑的可溶性还原测定，用于评估抗体对 热带念珠菌 生物膜的影响

这种体外，基于96孔板的方案可用于测试新型抗真菌剂的抗体对念珠菌生物膜中真菌细胞代谢活性的抑制作用。与其他方法相比，这是一种高度灵敏、准确、高通量、可重复、用户友好且具有成本效益的技术，用于评估抗体或抗真菌药对念珠菌生物膜发育的影响。该测定可用于评估新型药物或基于抗体的疗法的疗效，以及针对念珠菌生物膜的候选疫苗，这些候选疫苗与侵袭性念珠菌病的严重程度有关。

该方法可用于测试新型抗真菌剂或抗体在不同环境中使用不同真菌菌株或抗体源在不同环境中形成或成熟过程中的效果。演示这一程序的将是Pankaj Chandley先生，他是在我的实验室工作的博士研究学者。首先，将 100 微升热带念珠菌培养物添加到 96 孔微量滴定板中。

使用多通道移液器，单独用 100 微升 RPMI 1640 MOPS 培养基填充最后两列。用盖子和铝箔盖住微量滴定板，并在静止条件下在 37 摄氏度下孵育板 24 小时。第二天，使用多通道移液器小心吸出培养基。

在印迹纸上轻轻倒置板，然后轻拍以去除任何残留培养基。使用多通道移液器用200微升1X PBS清洗板。使用多通道移液器小心吸出PBS，并用PBS洗涤两次。

要去除多余的PBS，请在生物安全柜内的室温下风干板30分钟。在无菌RPMI 1640 MOPS培养基中制备热灭活血清样品的连续稀释液。向96孔微量滴定板的每个孔中加入100微升选定的血清稀释液。

在第 10 列中，仅添加 RPMI 1640 MOPS 培养基用于纯真菌阳性对照。向第11列中的所有孔中加入1至50稀释的血清，作为无真菌加血清阴性对照。用盖子和铝箔盖住板后，将板在 24 摄氏度下孵育 37 小时。

第二天，使用多通道移液器小心吸出血清后，轻轻敲击倒置板以去除任何残留的血清。重复PBS洗涤三次，并在生物安全柜内在室温下风干板30分钟，以干燥任何多余的PBS。然后，将 25 毫克 XTT 溶解在 50 毫升过滤灭菌的林格氏乳酸中。

在单独的管中等分10毫升。用铝箔覆盖并存放在零下80摄氏度。接下来，将 8.6 毫克甲萘醌溶解在 5 毫升丙酮中。

在 50 个单独的微管中分配 100 微升后，将等分试样储存在零下 80 摄氏度。取XTT10毫升，加入甲萘醌1微升，即得1微摩尔工作溶液。每孔 96 孔微量滴定板加入 100 微升 XTT 甲萘醌溶液。

接下来，用盖子和铝箔盖住板后，在黑暗中将板在 37 摄氏度下孵育两个小时。最后，将80微升有色上清液从每个孔转移到新鲜的96孔板中，并在490纳米处读取板。来自Sap2-副疣免疫小鼠的血清可以防止预成型的热带念珠菌生物膜的成熟65%，而来自Sap2-白色念珠菌的血清为45%，在Sap2-热带免疫小鼠中为55%。

总体而言，Sap2免疫血清对生物膜的抑制显著高于假免疫血清，在免疫前血清中分别为16%和13%。使用PBS和无血清对照的生物膜抑制几乎可以忽略不计。在执行洗涤步骤时应格外小心，以防止生物膜的破坏。

XTT溶液应在使用前制备，并立即添加到平板中。按照此过程，用户可以在不同的研究环境中使用不同的真菌菌株评估新型抗真菌剂、候选疫苗或抗体在念珠菌生物膜形成和成熟过程中的效果。