dd-PCR是一种高度灵敏且准确的靶DNA或RNA绝对定量方法。它已被用于其他常规方法无法给出准确结果的疾病诊断。dd-PCR是检测极低丰度核酸分子的最灵敏技术。
与定量PCR不同，dd-PCR不需要任何管家基因控制即可进行定量。由于其灵敏度和准确性，dd-PCR可用作分子诊断和研究的工具，涉及低丰度RNA分子，如microRNA和环状RNA。在使用dd-PCR之前，应进行RT-PCR或RT-qPCR，以确认引物正在扩增其靶基因，而无需任何非特异性PCR扩增。
首先，通过将总环状RNA序列长度的最后100个核苷酸连接到环状RNA序列的前100个核苷酸来制备长度为200个核苷酸的PCR模板序列。使用由入门 3 Web 工具设计的引物模板序列。取一个含有约500万个增殖C2C12肌母细胞的10厘米培养皿和一个为期四天的分化C2C12肌管进行RNA分离。
用10毫升1X PBS洗涤细胞三次，然后用移液管丢弃PBS。加入一毫升RNA分离试剂，通过剧烈移液裂解细胞。然后，加入200微升氯仿并涡旋15秒。
将试管在4摄氏度下以12， 000 G离心10分钟.取400微升上层水层，将其装入硅胶柱上，并在室温下以12， 000 G离心一分钟。将流量通过新管并加入 600 微升 100% 乙醇。加入 20 微升磁性硅胶珠，将管子放在温度混合器上，设置为 25 摄氏度和 1， 200 rpm，持续五分钟。
然后，将管子放在磁性支架上 30 秒或直到溶液变清。将磁性硅胶珠重悬于含有90%乙醇的500微升洗涤缓冲液中。将试管放在磁性支架上30秒后，让珠子沉向磁铁并使用移液器丢弃缓冲液。
在热混合器上以 50 摄氏度风干管子三分钟，保持盖子打开。加入20微升无核酸酶的水，重悬磁珠。将溶解的RNA收集在新管中，使用分光光度计进行数量和质量评估。
使用分光光度计测量RNA浓度，并取一微克RNA进行cDNA合成。将一微克总RNA与1微升dNTP混合物，四微升5X逆转录酶缓冲液，两微升10X逆转录酶随机引物，0.25微升逆转录酶和0.5微升RNase抑制剂混合。使用不含核酸酶的水将体积补足至20微升。
将试管置于 25 摄氏度下 10 分钟，然后放置 50 摄氏度一小时。然后将试管置于 85 摄氏度下五分钟以使酶失活。在0.2毫升PCR管或试管中设置22微升的PCR反应，以及阴性对照管和非模板对照管。
加入11微升dd-PCR预混液、5.5微升1微摩尔浓度的环状RNA特异性正向和反向引物混合物以及5.5微升无核酸酶水以设置NTC反应管。同样，要设置测试反应管，请加入11微升dd-PCR预混液，5.5微升1微摩尔浓度的环状RNA特异性正向和反向引物混合物以及5.5微升cDNA。为了产生液滴，将20微升PCR混合物从0.2毫升PCR管转移到液滴发生器盒的样品孔中。
使用移液管小心地将70微升液滴发生油添加到液滴发生器盒的油井中。用橡胶垫圈盖住液滴发生器滤芯，并将其放入液滴发生器机中，以获得在液滴发生器滤芯的液滴孔中产生的样品油滴混合物。对于PCR扩增，使用移液管将40微升样品油滴混合物从液滴发生器盒的液滴孔转移到96孔PCR板中。
用铝箔封口机密封96孔PCR板。将其放入封板机块中，在180摄氏度下预热，然后单击密封以密封PCR板。然后，将板放入dd-PCR热循环仪中，并将盖子温度设置为105摄氏度，升温速率设置为每秒2摄氏度。
PCR结束后，将板放在dd-PCR液滴计数器机上，将板架置于正确的位置以计数液滴。打开液滴分析软件，通过输入样品信息来设置运行。点击分析按钮，分析液滴读数完成后的数据。
然后，单击 1D 振幅按钮以查看正极和负极液滴。要将正液滴与负液滴分开，请为具有相同目标的所有样品设置一条通用阈值线。单击导出按钮将环状RNA计数数据导出为csv文件。
导出的数据显示了每个样品中存在的环状RNA的数量。通过考虑每个反应中使用的cDNA总量，手动计算每个样品中每纳克RNA的环状RNA数量。此处显示了使用QuantaSoft软件的数据分析。
除MT1外，所有样品均显示超过12， 000个液滴计数。由于MT1中的总液滴数较低，因此最终数据分析不考虑该样品。有趣的是，与肌母细胞相比，在4天分化肌管条件下，Circ B和C2的表达模式存在明显差异。
对Circ B和C2丰度的拷贝数分析表明，3个重复的C2C12成肌细胞每纳克RNA分别为76.8、67和46拷贝，而2个肌管样品的拷贝数分别为每纳克RNA558和610拷贝。条形图中的数据表示两到三个生物学重复的平均值正负标准偏差。ddPCR是测量靶环RNA准确差异表达的最先进方法之一。
这种方法将成为未来一年加速环状RNA研究和诊断行业的重要工具。
