该协议允许精确确定同步出芽酵母细胞中的S相持续时间。这是一种快速、简单且可重复的方法。此外，它足够灵敏，可以检测经典方案无法检测到的轻度合成缺陷。
这种方法对于许多研究出芽酵母细胞周期调节的研究人员很有用。展示该协议的将是高级研究员Nicolas Talarek和实验室的博士生Juan De Dios Barba Tena。在10毫升SC培养基中以低细胞浓度接种酿酒酵母细胞，以30摄氏度的速度进行过夜培养，以每分钟130转的速度进行轨道搅拌。
第二天，将细胞稀释在20毫升新鲜SC培养基中，终浓度为每毫升10至6个细胞的两到三倍。在40微升每毫升1毫克α因子稀释在水中。然后在30摄氏度下培养细胞，以每分钟130转的速度进行轨道搅拌，持续一小时。
重复此步骤一次。在光学显微镜下可视化细胞以监测G1停滞。如果超过 90% 的单元格显示 shmoo，而其他单元格是圆形的未对接单元格，则继续。
将样品在1， 500G下离心三分钟，然后用真空移液管弃去上清液并将细胞重悬于20毫升SC培养基中。重复此步骤一次。每五分钟收集两次一毫升细胞，然后进行EDU标记。
释放后 30 分钟加入 400 微升 α 因子。将一毫升细胞培养物转移到含有一微升10毫摩尔EDU的两毫升微量离心管中，通过倒置充分混合。为了在Pi EDU双变量事实上区分EDU阳性细胞和EDU阴性细胞，将另外一毫升细胞培养物转移到含有一微升DMSO的两毫升微量离心管中。
在 30 摄氏度下在摇动的水浴中搅拌孵育三到五分钟。通过加入100微升100%乙醇来停止反应。在微量离心机中以10， 000G沉淀细胞两分钟。
使用真空移液器除去上清液。将细胞沉淀重悬于500微升70%乙醇中，并通过涡旋充分混合。将样品在室温下以每分钟20次倾斜的速度在变速摇杆上放置至少一小时，以渗透细胞。
在微量离心机中以10， 000g沉淀细胞两分钟，并用真空移液管弃去上清液。用500微升10%乙醇和PBS洗涤细胞两次。在微量离心机中以10， 000G沉淀细胞两分钟，并用真空移液管弃去上清液。
将沉淀重悬于含有RNase A和蛋白酶K的200微升PBS中，在50摄氏度下孵育一至两个小时，偶尔摇动，或在37摄氏度下孵育过夜。在微量离心机中以10， 000G沉淀细胞两分钟，并用真空移液管弃去上清液。用500微升PBS洗涤细胞。
然后沉淀细胞并丢弃上清液，如前所述。将细胞沉淀重悬于含有1%BSA的200微升PBS中。在室温下孵育30分钟。
然后沉淀细胞，如前所述弃去上清液，并将沉淀重悬于含有1%BSA的300微升PBS中。将细胞分配到两个1.5毫升微量离心管中。第一个管应包含用于Click反应的200微升细胞培养物，第二个管应包含100微升用于Sytox绿色染色的细胞培养物。
然后，如前所述沉淀细胞并丢弃上清液。对于系统毒素绿色染色，将细胞沉淀重悬于100微升PBS中。然后根据细胞浓度，将10至30微升转移到含有300微升Sytox绿色混合物的流式细胞仪管中。
以40%至50%的振幅对样品进行两次超声处理两次，持续两秒钟在黑暗中放置，直到在流式细胞仪上处理样品。对于Click反应，用40微升新鲜制备的叠氮化物染料缓冲液重悬细胞沉淀。在室温下在黑暗中孵育60分钟。
如前所述沉淀细胞并丢弃上清液。然后用300微升10%乙醇在PBS中洗涤细胞三次。接下来将细胞重悬于PBS中的100微升50微克/毫升碘化丙啶中，并在黑暗中放置10分钟。
根据细胞浓度，将10至30微升细胞悬液转移到含有300微升50毫摩尔Tris HCl，pH 7.5的流式细胞仪管中。超声处理两次，每次两秒钟，振幅为 40 到 50。将样品放在黑暗中，直到在细胞仪上处理它们。
使用488纳米的激发蓝色激光和530×30带通滤光片读取Sytox绿色样品。使用 488 纳米的激发蓝色激光和 Pi X 轴的 615 x 20 带通滤光片和 640 纳米的红色激发激光器、Y 轴的 660 x 20 带通滤光片在点图上读取巴伐利亚 Pi EDU 样品。在双变异EDU Pi细胞仪分析中观察到三个细胞群。
在25摄氏度下，大约27%的细胞群处于G1期，29%处于S期，约44%处于G2加M期。在同步细胞中，S期的持续时间可能约为25分钟，具体取决于Sytox绿色流式细胞仪谱上的DNA含量从1C变为2C的时间。EDU脉冲标记准确确定了S相持续时间。
释放15分钟后，检测到一小部分EDU阳性细胞，表明S期开始。通过S期的进展是通过巴伐利亚Pi EDU图中的细胞云向上和向右移动看到的。最后，在释放后35分钟，一小部分细胞为EDU阴性，但DNA量的两倍表明S期结束，细胞处于G2加M期。
尽管观察到高度同步，但一些细胞在释放后60分钟完成S期，整个群体的S期在释放后约65分钟完成。保持完美的同步并防止细胞进入第二个S期至关重要。细胞可以用显微镜成像，其中可以监测和量化核DNA复制远见。
该技术将有助于识别具有轻度S期缺陷以及细胞周期持续时间缺陷的忽视突变体。
