该协议允许研究人员同时测量原代T细胞中的钙反应，同时评估其亚群和表面表型。这种技术的主要优点是它避免了在检查其钙反应之前分离特定细胞亚群的需要。首先，通过将 50 微升 DMSO 添加到含有 50 微克 Indo-1 AM 的小瓶中，制备每微升 1 微克的 Indo-1 AM 储备溶液。将储备溶液稀释成适当体积的cRPMI，浓度为每毫升6微克。
将培养基放入 37 摄氏度的水浴中。然后使用该培养基以一比一的比例稀释先前制备的细胞悬液，以获得每毫升5至600万个细胞。接下来，向12孔组织培养板中，每个实验条件每孔加入一毫升细胞悬液。
通过将EGTA添加到Indo-1染料负载细胞中，制备用于无钙Indo-1的单个染色对照样品。准备一个没有荧光团或Indo-1染料的生物阴性对照孔。通过在流式细胞仪上向染料负载细胞悬液中加入浓度为50微摩尔的离奥霉素来制备Indo-1阳性对照。
此外，使用抗体偶联荧光团为其他细胞群的单染色质控品准备孔。然后每百万个细胞加入两微克FC受体阻断抗体，并将板孵育45分钟，每15分钟敲击一次以重悬细胞。孵育后，混合并从平板中除去整个体积的细胞，并将其添加到1.7毫升微量离心管中。
离心并倒出上清液。用一毫升预热的cRPMI洗涤细胞后，再次沉淀并倒出上清液。将细胞重悬于一毫升cRPMI中并孵育每个试管，使试管顶部略微打开以进行气体交换，从而使细胞内AM酯完全脱酯。
接下来，制备所有用户定义的荧光染料偶联抗体的预混液，并将其添加到静息细胞中，以获得一毫升的细胞体积。休息后，沉淀细胞并通过重悬于一毫升冷却至四摄氏度的cRPMI中来洗涤沉淀。重复此步骤并将试管放在冰上。
使用带盖的 5 毫升聚苯乙烯流管将单个样品重悬于 500 微升无酚红 cRPMI 中。为了使用钙通量分析保持温度，通过在小水浴中加入浴珠并将其加热至37摄氏度来准备珠浴。小心地将 50 毫升的编年史管切成两半，然后丢弃管的顶部。
用浴珠填充剩余管的四分之三，并在珠浴中使其达到 37 摄氏度。将珠浴放在流式细胞仪附近，并用泡沫塑料架放置试管。在流式细胞仪上分析之前，将试管分别加热至37摄氏度7分钟。
登录流式细胞仪软件，然后单击库选项卡。然后选择荧光标签以添加钙结合的 Indo-1 和无钙的 Indo-1。然后在荧光标签组下选择紫外激光，然后单击添加以添加荧光标签名称。
选择激光激发和发射波长，然后单击保存。继续实验设置。单击采集选项卡，打开/创建新实验并将所需的荧光标签添加到实验中。
为实验创建一个参考组和一个新的样本组，并标记这两个组。在“采集”选项卡下，将要记录的事件设置为最大值为 1000 万，停止体积设置为最大体积 3000 微升，停止时间设置为最大 36， 000 秒。采集多色组合中包含的用户定义偶联抗体和 Indo-1 功能染料的单染色对照。
向钙结合的Indo-1阳性对照中加入50微摩尔离奥霉素并涡旋。将流管添加到样品进样板，然后单击记录。然后将无钙Indo-1阴性对照添加到流式细胞仪中，然后单击记录。
通过单击“取消混合”按钮来解混合单个染色的对照。解混完成后，使用未混合工作表创建连续图，例如 SSC-A 与 FSC-A，用于去除样品中的碎片，SSC-A 与 SSC-H 用于去除双峰。然后通过单击“绘图”创建门。
将图添加到工作表中，然后在门内双击以创建下游门控种群。继续，直到考虑所有感兴趣的人口。接下来，将先前制备的单染色对照样品加热至37摄氏度以进行顺序分析。
设置流式细胞术软件，在冰水中运行去离子两到三分钟，以确保流式细胞仪的流体稳定性。通过使用面矩形或椭圆门按钮创建门以包括感兴趣的人口，在未混合工作表上设置顺序图。在浇口内双击，将 y 轴和 x 轴参数更改为 SSC-A 而不是 SSC-H。
通过左键单击轴完成轴参数的定义。创建具有SSC-A与活性染料信号的图。对胺染料染色呈阴性的活细胞进行门控门。
活死染色阴性的活细胞将在y轴和x轴上的零标记处聚集。双击内部图以创建一个仅包含单细胞活淋巴细胞的新图。在 x 轴上将 Y 轴更改为 Indo-1 与时间的关系，以可视化钙内流。
接下来，将加热的生物样品放入机器的SIT中。以中等流速每秒 2， 500 至 3000 个事件运行样品，以可视化有限数量的细胞群中的钙内流。在采集控制中将下一个管子添加到珠浴中。
按记录以记录30秒的初始数据，以获得样品中钙信号传导的基础水平。然后单击停止并从样品进样口取出试管。将 30 μg 非偶联抗 CD3 直接加入样品管中以引发钙内流。
快速将试管放回样品进样口，然后在软件中按记录。记录数据七分钟，观察软件中采集控制下经过的时间。然后按 停止 在软件中。
每毫升离奥霉素加入一微克并记录30秒，以获得感兴趣细胞中的最大钙信号。继续下一个样品并重复工作流程，直到收集完所有样品。保存实验并单击导出 zip 文件。
未混合的文件被上传到外部流式细胞术分析软件。时间图与侧向散射图中的稳定一致信号表明流体稳定性。对淋巴细胞群进行门控，然后在侧散射高度与面积的图上区分单胞胎。
评估单体的生存能力。然后对CD19阴性群体应用门控。这些T细胞亚群使用CD4和CD8抗体通过可视化钙结合的Indo-1荧光与时间的关系来评估。
在单个细胞群中，钙结合的Indo-1与时间的关系图显示了刺激前的基线。随着细胞内钙水平下降和添加离子霉素引起的钙反应，达到峰值反应。在添加抗CD3抗体之前，检测到微弱的钙结合Indo-1信号。
在峰值响应期间，细胞显示出强烈的钙结合Indo-1信号和减少的无钙Indo-1。在峰后五分钟，Indo-1荧光几乎恢复到基线。加入离奥霉素后，观察到钙结合的Indo-1的强信号，表明细胞的染料负载充分。
对稀有种群的分析是通过在每个感兴趣的种群进行门控后绘制钙结合的Indo-1与无钙的Indo-1来进行的。并分析每个子集在整个时间过程中的钙反应。使用全谱分析的钙通量可以在各种免疫亚群中进行高参数流式细胞术分析。
用于 T 细胞亚群无偏聚类的高维分析可与高参数流式细胞术结合使用以进行高级分析。该技术是为分析大量样品中多个免疫亚群而开发的。
