该协议描述了小鼠模型中IL-33测定后肺IMS的分离和过继转移，这可以促进特发性肺纤维化的体内研究。该技术使研究人员能够探索巨噬细胞的功能，由传统细胞因子模拟IPF发展。首先，从冰箱中取出一瓶氯膦酸盐脂质体。
让它在室温下加热 30 分钟，然后倒置几次以确保混合均匀。使用带有无菌吸头的移液管吸出60微升氯膦酸盐脂质体。将对照和药物滴入麻醉小鼠的鼻腔中。
每次滴后，确保小鼠完全吸入药物并均匀呼吸。在受体小鼠中肺泡巨噬细胞耗尽后，首先用75%酒精和碘对麻醉宿主小鼠的皮肤进行消毒。用剪刀剪开皮肤，露出心肺组织。
在配备20号针头的注射器中吸出10毫升PBS，并将针尖插入小鼠的右心房。然后用手术剪刀切割小鼠的下腔静脉，并以每分钟10至20毫升的恒定速度手动用PBS灌注小鼠，直到肺组织变白。此外，切除肺组织并将其转移到培养皿中的冰冷PBS中。
将肺组织切成碎片，加入15毫升含有1%胶原酶A的DMEM培养基以分离巨噬细胞，然后在37摄氏度的摇床上以100 RPM孵育30分钟。通过10毫升注射器吸出肺组织悬浮液约20次以使其精细。通过40微米细胞过滤器过滤悬浮液。
将滤液以400G离心10分钟。弃去上清液后，用三毫升细胞裂解缓冲液在冰上裂解红血两至三分钟。以 150 G 离心五分钟，然后将细胞沉淀重悬于 10 毫升 DMEM 中。
然后使用血细胞计数器计数细胞。将细胞接种到10厘米的贴壁细胞培养皿中，并在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育一小时，以将肺间质巨噬细胞粘附在培养皿上。一小时后，吸出上清液和浮动细胞。
加入 10 毫升新鲜、完整的培养基，孵育超过 8 小时或过夜。为了刺激分离的间质巨噬细胞，用完整的白细胞介素33替换用过的培养基。还通过添加PBS代替白细胞介素33来制备对照板。
将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 24 小时。要解离肺间质巨噬细胞，请用一毫升0.25%胰蛋白酶治疗五分钟。然后加入三毫升新鲜培养完全培养基淬灭消化并离心细胞悬液收获肺巨噬细胞。
计数细胞后，将细胞重悬于PBS中至终浓度为每50微升10至第五个细胞的五倍。为了开始转移间质巨噬细胞，将麻醉受体小鼠的四肢固定在带有医用胶带的垂直板上，并使用棉签轻轻地将小鼠的舌头拉到一侧。打开插管灯后，将其照在小鼠的喉咙上，以查看气管，气管应靠近舌根。
使用 22 号插管灯和 0.4 毫米直径导丝将留置针套管插入气管。要完成插管，请取下导丝并将套管推入小鼠气管。现在，当看到套管进入气管时，通过气管将50微升细胞悬液注射到受体小鼠中。
24 小时后，通过气管给予博来霉素以诱导特发性肺纤维化。同时向对照组施用等体积的盐水。21 天后，通过评估纤维化标志物的表达和 Ashcroft 评分来确定肺纤维化的严重程度。
HE染色显示，与对照组相比，白细胞介素33刺激巨噬细胞的过继转移加剧了博来霉素刺激小鼠的肺组织破坏程度并增加了成纤维细胞聚集。阿什克罗夫特评分的增加也说明了肺纤维化的程度。与BLM处理的野生型小鼠相比，含有过继转移白细胞介素33刺激的间质巨噬细胞并用博来霉素处理的受体小鼠肺组织中α SMA和纤连蛋白的mRNA表达水平更高。
应立即用一毫米注射器将500微升空气输入肺部，以确保套管中的细胞悬浮液能够完全进入肺组织。
