胎儿小鼠骨骼肌3D脱细胞基质的制备用于细胞培养

据我们所知，该协议是第一个从胎儿骨骼肌产生去细胞化基质的协议，为研究在子宫内开始发展的肌病提供了一种新方法。该协议生成发育和组织特异性指标，可用于研究肌肉细胞行为以及与受控环境中细胞外基质的相互作用。LAMA2-CMD是一种先天性肌肉营养不良症，在出生时就开始显现。

该模型可以帮助解开其发病所涉及的模式机制，并导致新的靶向治疗。该方案可以适应不同的组织和疾病模型。根据基质和细胞类型，可以实现不同的复杂程度，证明了系统的多功能性。

这是一个非常简单的协议。最具挑战性的部分是样品的收集和处理。但是，通过练习，可以轻松提高技术技能。

首先一次将一个安乐死的胎儿转移到含有冰冷PBS的培养皿中。切除皮肤和四肢后，切开胸腔的腹侧。切除胸骨和下层器官。

将胎儿背侧朝上，并切除椎体的颈部部分。接下来，切除背部脂肪沉积物和深部肌肉结缔组织。现在，使用手术镊子固定胸腔。

用微型手术刀小心地刮擦以将背部深层肌肉与周围组织分离。将组织储存在PBS中的4摄氏度的12孔细胞培养板中以备将来使用。长时间，将组织储存在零下80摄氏度的空微量离心管中。

第一天，使用整个外轴肌团。向 12 孔板的每个孔中加入 3 毫升含有 1% 青霉素和链霉素的低渗缓冲液。向每个孔中加入肌肉组织碎片，并在搅拌下孵育过夜18小时。

第二天，用细头移液器取出缓冲液。现在用三毫升PBS洗涤样品三次，每次搅拌一小时。丢弃PBS后，将样品在搅拌下在三毫升0.05%SDS洗涤剂溶液中孵育24小时。

在第三天，使用细吸头移液管去除SDS洗涤剂，并用三毫升低渗洗涤缓冲液洗涤碎片三次，每次搅拌20分钟。用两毫升DNase溶液替换孔的溶液，并在搅拌下将组织碎片在37摄氏度下孵育三小时。取出DNase溶液后，用三毫升PBS洗涤碎片三次，每次搅拌20分钟，最后一次洗涤过夜。

向接种有亚汇合C2C12细胞的T-25烧瓶中，加入500微升胰蛋白酶并重悬于一毫升完全培养基中。将10微升悬浮液与10微升台盼蓝染料混合，并加载到血细胞计数器中以计数细胞数量并估计活力。在层流罩中，将去细胞化基质或dECMs放入含有含有1%青霉素和链霉素的PBS的培养皿中。

使用微型手术刀和镊子将基质分成小块。将碎片转移到96孔板的孔中，每孔放置三到四件。向每个孔中加入200微升预热的完全培养基，并将板在37摄氏度下用5%二氧化碳孵育两小时。

将培养基丢弃在孔板中，并向每个孔中加入200微升含有50， 000个活C2C12细胞的完整培养基。孵育孔板两天。将带有细胞的dECM转移到含有400微升完全培养基的48孔板中。

每两天小心吸出培养基以防止基质脱离，并补充新鲜培养基直到第八天。为了分化，用分化培养基替换完整的培养基，孵育四天直到第12天。肌肉组织在分离后立即呈红色，并在低渗缓冲液中孵育后由于细胞裂解而变白。

SDS使肌肉变得透明。脱氧核糖核酸酶处理后，获得更小、更透明的dECM。DNA定量显示，与天然组织相比，dECM减少了近100%。

dECM和天然组织对层粘连蛋白α2和层粘连蛋白的管状染色相似。天然组织的蛋白质印迹分析显示层粘连蛋白α两个亚基有两个条带，而在dECM中检测到三个较小的条带。对于总层粘连蛋白，与天然组织相比，dECM样品显示出蛋白质片段化。

纤连蛋白和胶原蛋白I存在于天然组织细胞和dECM之间的间质空间中。两个样品中都存在相似的纤连蛋白条带，表明它不受去细胞化的影响。在dECM中观察到较少的胶原蛋白I条带。

对于胶原IV，两个样品都显示出相似的管状染色。然而，dECM条带的分子量较低。C2C12细胞在dECM中定植和增殖，并融合成多核肌管。

这些在分化培养基中孵育四天后表达肌球蛋白重链蛋白。观察层粘连蛋白α二链、总层粘连蛋白和纤连蛋白的细胞内和细胞周染色。脱细胞化胎鼠骨骼支架可用于在共培养系统中培养细胞，使其更接近体内情况，因此有助于了解肌肉疾病。