使用创新的无异种方法进行人类治疗，分离和培养人脂肪来源的干细胞

我们用于分离和体外扩增人类脂肪来源干细胞的无外源性方法是在考虑用于转化应用时解决细胞疗法生物安全问题的答案。我们的分离和扩增方法易于复制，快速且技术要求低，因此对每个人都有用。我们研究了基于人类脂肪干细胞的周围神经修复治疗策略。

然而，当在不同的临床研究设置中需要新的脂肪干细胞时，我们的技术可以得到广泛应用。我们保持简单，以节省更容易的可生产性。从手术室到细胞培养，应仔细观察无菌情况。

对于样品操作和碎片，显微解剖有污染的风险。从腹部整形手术中获得脂肪组织样本后，使用无菌剪刀将其切成约一平方厘米的碎片。用手术刀将每块碎片微观解剖成更小的碎片，并将五个碎片分散在10厘米的培养皿中。

对于碎片附着，使用手术刀在塑料表面上创建切口并拖动每个碎片。轻轻地加入 10 毫升完全培养基以覆盖所有片段而不分离它们，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育培养皿。每天在光学显微镜下监测人类脂肪来源的干细胞（HASC）的扩增，直到细胞汇合。

每72小时用新鲜的完全培养基替换培养基以去除细胞碎片，并让它们生长直到第一次传代。一旦HASC培养物达到70%至80%的汇合度，使用无菌镊子去除并丢弃所有组织碎片。此外，丢弃耗尽的培养基，避免HASC与培养皿分离。

用10毫升PBS仔细清洗细胞。去除PBS后，加入一毫升无动物胰蛋白酶，并在37摄氏度下孵育五分钟。在光学显微镜下检查细胞脱落，如果需要，再孵育两分钟。

要支撑细胞分离，请轻轻敲击塑料表面。通过加入两毫升完全培养基停止胰蛋白酶作用，并将所有细胞收集在15毫升管中。通过离心除去剩余的胰蛋白酶。

弃去上清液后，将细胞悬浮在5毫升完全培养基中，并将细胞悬液转移到新的T25烧瓶中。为了冷冻保存，使用光学显微镜下的细胞计数器计数分离细胞的等分试样。将细胞以300 G离心五分钟。

弃去上清液后，将细胞以每毫升10至第六个细胞的密度悬浮在冷冻混合物中，并将一毫升细胞悬液转移到一个冷冻瓶中。将零下80摄氏度的冷冻瓶放入冷冻容器中，每分钟将温度降低一摄氏度，然后将冷冻瓶移至液氮中长期储存。在最初的簇外观中，HASC表现出经典的纺锤状形状，并且与存在FBS的对照细胞相比更小，并且更细长。

用两种补充剂培养的HASC之间的细胞免疫表型似乎相似。超过80%至90%的HASC对CD73和CD105呈阳性，对CD34和CD45表示不到5%。最后，增殖测定显示，与FBS对照相比，将人血小板裂解物添加到培养基中时，细胞生长显着增加。

最重要的步骤是脂肪碎片的显微解剖及其在培养皿上的手术刀切口附着。根据GMP生物安全标准获得即用型人脂肪来源的干细胞群，保持治疗细胞特性并增强细胞增殖。