微凝胶-细胞外基质复合材料支持人类神经结构的嵌入式3D打印

SHAPE复合材料中的嵌入式3D打印克服了传统的生物制造限制，能够对类似于天然细胞外环境的水凝胶内的机械敏感组织进行准确的图案化。SHAPE工具箱依赖于模块化生物材料设计，可以轻松更改打印载体配方。它还利用低成本材料和可访问的设备，以便其他研究小组进行简单的调整。

这种方法可用于创建空间定义的人类神经组织模型，以检查帕金森氏症等神经退行性疾病的神经元发育和通信。首先在超纯水中以每毫升2毫克的浓度制备碳酸钙溶液。将其与海藻酸盐溶液以相等的比例混合，并在室温下以650RPM磁力搅拌一小时。

然后以1：500的比例向该混合物中加入乙酸，并再次搅拌过夜。第二天，使用均质机将胶冻的藻酸盐溶液机械地破碎成15， 000RPM的微粒10分钟。然后离心得到微粒。

小心地弃去上清液并将颗粒重悬于含有两毫摩尔氢氧化钠和1%青霉素链霉素的DMEM中。悬架的颜色应变回红色。将悬浮液在四摄氏度下孵育过夜。

孵育后，将悬浮液在15， 000 RPM下匀浆3分钟，并以18， 500 G离心10分钟。离心后，除去上清液并观察沉淀中紧密包装的藻酸盐微粒。要生成SHAPE复合材料，请将藻酸盐微粒颗粒与稀释和中和的胶原蛋白以二比一的比例混合，然后在冰上上下移液。

将生成的复合材料转移到冷却的24孔板中。打印前，使用 0.025% 胰蛋白酶溶液在 37 摄氏度下解离先前培养的人神经干细胞或 hNSC。然后用生长培养基中和胰蛋白酶，并在室温下以400G离心细胞悬液5分钟。

除去上清液后，将细胞沉淀重悬于两至三毫升生长培养基中。使用 21 号钝金属针头，将 100 微升紧密包装的藻酸盐微粒装入注射器中。然后将准备好的细胞悬液装入注射器中。

对于打印，请用 27 号钝金属针替换装载针。使用参考软件，设计出要打印的结构后，单击生成以生成 G 代码。将细胞加载的注射器插入基于挤出的生物打印机上的容积式挤出头中，并通过单击开始针头长度测量过程来记录针头长度。

然后将装有SHAPE复合材料的24孔板放在打印机上，然后单击SHM以测量空孔表面高度。选择 pH 2，然后选择扳手符号。然后在参数集下，将体积流量更改为每秒 3.6 微升，然后按应用参数，然后按保存并完成。

通过单击打开的 G 代码图标将 G 代码加载到打印机用户界面中。选择运行程序的图标以启动打印过程。打印后立即将SHAPE凝胶在37摄氏度下孵育30分钟进行退火。

然后将生长培养基轻轻添加到退火的SHAPE凝胶载体中。对于免疫染色，从凝胶中去除多余的培养基，并使用刮刀将凝胶转移到含有DPBS的容器中。将板放入通风橱后，取出 DPBS。

用4%甲醛溶液覆盖凝胶，并在室温下孵育一小时。用DPBS洗涤后，将封闭溶液加入凝胶中。轻轻摇动板并在室温下孵育六小时以防止非特异性结合。

除去封闭溶液后，将一抗添加到凝胶中并轻轻摇动。将板在 4 摄氏度下孵育 48 小时。DPBS洗涤后，用二抗溶液同样处理凝胶24小时。

成像前，用刮刀将染色凝胶放入具有薄成像底部的孔板中。在本研究中，hNSC墨水打印了直径约为200微米的细胞细丝。打印的链富含具有相似形态的活细胞。

打印30 d后，细胞表现出小细胞体和长薄过程的神经形态，表明hNSCs成功分化。用微管蛋白β3染色允许可视化生成的神经网络，并保持几何形状。在分化过程中，细胞没有从打印的链中迁移出来。

SHAPE复合材料可用于通过印刷牺牲油墨而不是细胞来产生可灌注通道。此外，支持可以包括氧敏珠，以监测3D打印结构中的氧张力随时间和空间的变化。