我们的总体研究重点是开发通过光实现蛋白质活性的精确时空控制的光遗传学方法。我们设计了称为 lightR 的光调节结构域，用于变构调节，使我们能够研究时空控制的蛋白质活性如何影响细胞信号传导和功能，从而有助于临床前疾病建模和治疗开发。光遗传学面临多项挑战，包括实现靶蛋白活性的精确和可逆控制以及准确模拟内源性信号动力学。
关键问题是防止不必要的激活、实现靶向亚细胞激活以及管理光毒性以保持细胞活力。此外，开发普遍兼容且耐用的工具对于提高应用的多功能性和可重复性至关重要。我们的 lightR 工具工程方案独特地将多种高级功能结合到一个系统中，包括变构调节、高灵敏度、空间分辨率、严格的时间控制和精确的信号特异性。
这种整合允许跨不同靶蛋白的可调性，解决了其他方法中可能缺乏这些关键功能中的一种或多种的差距。我们对定义调节细胞迁移的关键信号传导和结构过程感兴趣。我们的目标是利用我们的光遗传学技术来剖析内皮细胞迁移和相互作用的调节。
了解内皮细胞如何介导细胞外基质的重塑，并确定这些过程的失调如何导致疾病发展。对于每个实验组，将 3.5 厘米细胞培养皿中 6 个 lin XE 细胞的 1 次方 1 倍进行生化分析，将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 16 至 18 小时。第二天，使用合适的转染试剂用选定的 DNA 构建体转染细胞。
用铝箔盖住培养皿，然后将其放回培养箱中。转染 16 至 18 小时后，将 465 纳米 LED 面板灯系统置于组织培养箱内。将穿孔有机玻璃面板放置在灯上方 10 厘米处，以实现每平方厘米 3 毫瓦的照明。
在表达 LightR-Src 和 D388 R-LightR-Src 的细胞中使用连续照明。手动打开和关闭 LED 面板以控制照明。在实验时间点结束时，在安全的红光下收获细胞，吸出培养基并用冷 PBS 洗涤细胞。
使用工程化 LightR-Src 对 lin XE 细胞进行全局照射 60 分钟，显示 Src 底物、内源性桩蛋白的磷酸化，表达催化失活 D388 RLightR-Src 突变体的 p130Cas 细胞在全局照射下显示 Src 底物没有磷酸化。首先，在细胞培养基中，以每 35 毫米组织培养皿 5 个 hela 细胞的幂 2 乘以 10 进行铺板。将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 2 小时。
一旦细胞贴壁并达到 60% 至 70% 的汇合度，用给定的混合物共转染 hella 细胞。用铝箔盖住培养皿，以防止细胞意外照射。然后将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 16 至 18 小时。
接下来，将直径为 25 毫米、厚度为 0.17 毫米的有盖玻璃放入六孔板室中。在 PBS 中涂上每升 5 毫克纤连蛋白，并在 37 摄氏度下孵育过夜。然后在转染后 16 至 18 小时用 PBS 冲洗盖玻片。
在安全的红光下收集转染的 hela 细胞，然后在安全的红光下将 5 个转染的 hela 细胞的幂播放大约 1 乘以 10 次，放到每个盖玻片上。用铝箔盖住板，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的细胞培养基中孵育 2 小时。接下来，将准备好的成像介质和矿物油加热至 37 摄氏度。
然后用 PBS 洗涤含有细胞的盖玻片两次。染色和洗涤细胞后，小心地将盖玻片放入活细胞成像室中。向腔室中加入 1 毫升 L15 成像介质。
向介质中加入 1 毫升预热的矿物油，以防止成像过程中蒸发。保持腔室在 37 摄氏度下避光，直到准备好成像。将腔室放在预热至 37 摄氏度的显微镜载物台上。
选择同时表达快速 LightR-Src cherry 和 Src IRFP 的单个单元格。选择细胞内感兴趣的特定区域进行照明。对于这项研究，在所选单元格的外围选择一个小区域。
在照明前，在基础状态下每分钟对所选细胞进行成像 20 分钟。继续成像 50 分钟，同时局部照射，然后在激活后 20 分钟，总共 90 分钟。成像后，将电影保存为 tif 堆栈文件格式以供分析。
Hela 细胞的全局照明导致快速 LightR-Src 定位于黏着斑，一旦蓝光关闭，这种粘附就会逆转。这种照明还导致细胞扩散显着增加，一旦蓝光关闭，细胞扩散就会停止。催化失活的 D388 R-LightR-Src 突变体未显示细胞扩散。
表达快速 LightR-Src 的 hela 细胞的局部照明导致构建体在黏着斑中积累，导致 50 分钟照明下局部膜突起。在照明后 20 分钟的黑暗中未观察到进一步的面积增加。Fast LightR-Src 在暗相逐渐从黏着斑中消失。
单元质心向发光区域移动。快速 LightR-Src 激活后，表明细胞定向运动。
