Schnelle High Throughput Amylose Bestimmung in Gefriergetrocknete Potato Tuber Proben

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen hochdurchgestellt kolorimetrischen Methode, die auf der Bildung eines Komplexes zwischen Jod und Ketten von Glucosemolekülen in Stärke beruht. Jod bildet Komplexe mit sowohl Amylose und Amylopektin in langen Ketten. Nach der Zugabe von Jod zu einer Stärkeprobe, die maximale Absorption von Amylose und Amylopektin erfolgt bei 620 und 550 nm auf. Das Amylose / Amylopektin-Verhältnis kann aus dem Verhältnis der 620 und 550 nm Absorptionswerte geschätzt werden und deren Vergleich mit einer Standardkurve, in der spezifischen bekannten Konzentrationen an Absorptionswerte aufgetragen. Dieser hohe Durchsatz ist kostengünstiges Verfahren zuverlässig und reproduzierbar, so dass die Auswertung von großen Populationen von Kartoffel-Klonen.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen hochdurchgestellt kolorimetrischen Methode, die auf der Bildung eines Komplexes zwischen Jod und Ketten von Glucosemolekülen in Stärke beruht. Jod bildet Komplexe mit sowohl Amylose und Amylopektin in langen Ketten. Nach der Zugabe von Jod zu einer Stärkeprobe, die maximale Absorption von Amylose und Amylopektin erfolgt bei 620 und 550 nm auf. Das Amylose / Amylopektin-Verhältnis kann aus dem Verhältnis der 620 und 550 nm Absorptionswerte geschätzt werden und deren Vergleich mit einer Standardkurve, in der spezifischen bekannten Konzentrationen an Absorptionswerte aufgetragen. Dieser hohe Durchsatz ist kostengünstiges Verfahren zuverlässig und reproduzierbar, so dass die Auswertung von großen Populationen von Kartoffel-Klonen.

Einleitung

Etwa 80% des Frischgewicht einer Kartoffelknolle ist Wasser, fast alle der verbleibenden Trockenmasse ist Stärke ^ein. Der größte Teil der Stärke (70%) aus Amylopektin besteht, während der Rest Amylose. Das Verhältnis zwischen Amylose und Amylopektin ist die wichtigste Eigenschaft die Beeinflussung der physikalischen Eigenschaften der Stärke. Amylose ist ein lineares alpha 1-4 Zuckerkette, während Amylopektin ein lineares alpha-Kette mit 1-4 alpha 1-6 Verzweigungen ^2. Verfahren wie Jodbindung, Differential Scanning Calorimetry (DSC), Hochleistungs-Grßenausschlußchromatographie (HPSEC) und Concanavalin A-Wechselwirkungen zur Stärkebestimmung in verschiedenen Pflanzenspezies ^3,4 entwickelt. Jedes Protokoll erfordert besondere Fähigkeiten und Ausrüstung, was es schwierig zu skalieren, zahlreiche Proben zu einem Zeitpunkt zu quantifizieren. Die Methode, die wir hier vorstellen ist ein modifiziertes Protokoll von Hovenkamp-Hermelink et al. ^5, die ein Dual-Wellenlängen-Jod-Bindung istVerfahren, das auf gefärbten Stärkekörner. Die Vorteile dieser Methode gegenüber anderen sind die Amylose Bestimmung von roher Stärke ohne Reinigung es und die Verwendung der Dual-Wellenlängen-System, um die Genauigkeit der Methode ^4,6 zu erhöhen.

Protokoll

1. Amylose Bestimmung von Kartoffelknollenstärke

1. Schälen und schneiden frische Knollen in kleine Würfel schneiden.
2. Zeigen Kartoffelwürfel in kleinen braunen Taschen und über Nacht bei -80 ° C.
3. Übertragen Kartoffelwürfel auf Nylonbeutel und für die Gefriertrocknung.
4. Nach gefriergetrocknet, zermahlen die Kartoffelprobe zu Pulver mit Mörser und Stößel oder einer Wiley-Mühle.
5. In ein 50 ml Röhrchen, fügen 20-30 mg des gefriergetrockneten, Boden Knollenprobe.
6. Bereiten Sie eine Lösung von 45% (w / v) Perchlorsäure (Mischungs 24,4 ml 60% Perchlorsäure und 25,6 ml von ultra-reinem Wasser.
7. In 500 ul von 45% (w / v) Perchlorsäure und schütteln oder schwenken Sie um Stärkekörner zu verteilen.
8. Nach einem Vier-Minuten Inkubationszeit bei Raumtemperatur, fügen Sie 16 ml ultrareinem Wasser zu der Lösung und durch Vortexen mischen.
9. Nach der nicht-löslichen Material auf dem Boden der Röhre angesiedelt (7-10 min später), Transfer 40 ul der Lösung auf eine Mikrotiterplatte (Vermeidung der Pipettieren von Partikeln).
10. In 50 ul von Jod-Lösung (2 g KI + 1 g I ₂ in 900 ml Reinstwasser) und mischen Sie die Probe durch Pipettieren.
11. Die Absorption bei 550 nm und 620 nm sofort.
12. Bestimmen Sie die Amylose-Anteil nach Vergleich des Amylose / Amylopektin-Verhältnis von jeder Probe (620 nm/550 nm-Absorption) mit einer Standardkurve von Amylose und Amylopektin-Lösungen bei verschiedenen Konzentrationen erzeugt. Dieser Vorgang wird als nächstes beschrieben. Lesen des Rohlings (Jodlösung und Perchlorsäure) zusammen mit den Testproben. Verwendung tanzt Daten für die Analysen.

2. Amylose / Amylopektin-Kurve

1. In getrennten Röhren wiegen 12,5 mg Amylose und Amylopektin 12,5 mg.
2. Hinzufügen zu jedem Röhrchen 5 ml 45% (w / v) Perchlorsäure und vollständig aufzulösen.
3. Für jede der Lösungen (Amylose und Amylopectin), zu bringen, um ein Endvolumen von 50 ml mit ultrareinem Wasser.
4. Mix 6.25ml Amylose-Lager aus dem vorherigen Schritt mit 18,75 ml ultra-reinem Wasser. Damit wird ein 6,25 mg / ml Lösung Amylose.
5. Wiederholen Sie den Vorgang für die Amylopektin-Lösung.
6. Verwendung der Amylose-und Amylopektin-Standardlösungen aus den Schritten 2.4 und 2.5, bereiten die Prozent Amylose Standards, die 0-100% Amylose (100-0% Amylopektin) auf ein Endvolumen von 5 ml der Standardkurve in 10%-Intervallen zu schaffen.
   Zum Beispiel die Vorbereitung:
   Die 0% Amylose / Amylopektin 100% Standard-Pipette 5 ml Lösung Amylopektin.
   Die 10% Amylose / 90% Amylopektin-Standard, kombiniert 0,5 ml Amylose und Amylopektin 4,5 ml-Lösungen.
   Die 20% Amylose / 80% Amylopektin-Standard, kombiniert 1,0 ml Amylose und Amylopektin 4,0 ml-Lösungen.
   Die 30% Amylose / 70% Amylopektin-Standard, kombiniert 1,5 ml Amylose und Amylopektin 3,5 ml-Lösungen.
   Die 40% Amylose / 60% Amylopektin-Standard, kombiniert 2,0 ml Amylose und Amylopektin 2,0 ml-Lösungen.
   Die 50% Amylose/ 50% Amylopektin-Standard, kombiniert 2,5 ml Amylose und Amylopektin 2,5 ml-Lösungen.
   Die 60% Amylose / Amylopektin 40% Standard kombinieren 3,0 ml und 2,0 ml Amylose Amylopektin, und so weiter).
7. Transfer 40 ul jedes Standards Mischung auf eine Mikrotiterplatte. Fügen Sie einen gut mit 40 ul 45% (w / v) Perchlorsäure als leer.
8. In 50 ul von Jod-Lösung (2 g KI + 1 g I ₂ in 900 ml Reinstwasser) und mischen jede Probe (einschließlich Leerzeichen) durch Pipettieren.
9. Lesen Absorption bei 550 nm und 620 nm sofort und berechnen Sie die Amylose / Amylopektin-Verhältnis für jede Konzentration.

Ergebnisse

Die Standardkurve von tanzt Daten verschiedener Amylose / Amylopektin-Konzentration Lösungen konstruiert zeigt ungefähre Absorptionsverhältnis von 0,7 bis 1.6 (Tabelle 1). Eine lineare Regressionstrendlinie von diesen Daten werden später zum Ableiten Amylosegehalt in gefriergetrockneter Kartoffelproben (Fig. 1) verwendet.

Die Anlage Produktionsumgebung hat eine Wirkung auf die Amylose-Gehalt in der Kartoffelknolle ^7. Amylose repliziert Bestimm...

Diskussion

Amylose Gehalt in Kartoffelknollen typischerweise im Bereich von 20-35% ^7,8. Wenn die meisten Werte außerhalb dieses Bereiches, betrachten Sie diese möglichen Fehler: 1) Rohdaten wurden statt blendet Daten für den Bau des Amylose / Amylopektin-Standardkurve verwendet, 2) Rohdaten wurden statt blendet Daten für die Bestimmung der Amylose verwendet / Amylopektin-Verhältnis von den Kartoffelproben, oder 3) die für die Analyse verwendeten Wasser war nicht rein genug. Wir haben festgestellt, dass durch Verwe...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Amylose	Sigma	859656
Amylopectin	Sigma	A8515
Perchloric Acid 60%	Sigma	311413	Very hazardous to skin and eyes
Iodine	Sigma	23214TD
Potassium iodide	Sigma	08625JE
Equipment
Plate Reader	Bio Tek	ELx800