Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen Mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Zusammenfassung

Wechselwirkungen zwischen Proteinen sind von grundlegender Bedeutung für alle zellulären Prozesse. Verwendung Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer, kann die Wechselwirkung zwischen einem Paar von Proteinen in lebenden Zellen und in Echtzeit überwacht werden. Darüber hinaus können die Auswirkungen von potentiell pathogenen Mutationen zu beurteilen.

Zusammenfassung

Assays, die auf Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer (BRET) eine empfindliche und zuverlässige Mittel zur Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen zu überwachen. BRET ist die nicht-strahlende Energieübertragung von einem "Geber" Luciferase-Enzym, um eine "Akzeptor-Fluoreszenzprotein. Bei der häufigsten Konfiguration dieses Assays ist die Spender Renilla reniformis-Luciferase und der Akzeptor gelb fluoreszierendes Protein (YFP). Da die Effizienz der Energieübertragung ist stark abstandsabhängige Beobachtung des BRET Phänomen erfordert, dass der Donor und der Akzeptor in der Nähe sein. Um eine Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen von Interesse in kultivierte Säugerzellen zu testen, wird ein Protein als Fusion mit Luciferase und die zweite als eine Fusion mit YFP ausgedrückt. Eine Interaktion zwischen den beiden Proteinen von Interesse kann die Donor-und Akzeptor nahe genug für die Energieübertragung auftreten zu bringen. Im Vergleich zu anderen Techniken für die Untersuchung von Protein-Protein-inWechselwirkungen, die BRET-Assay ist empfindlich, erfordert wenig Handhabungszeit und einige Reagenzien und ist in der Lage, Wechselwirkungen, die schwache, vorübergehende, oder abhängig von der biochemischen Umgebung innerhalb einer lebenden Zelle gefunden werden, sind zu erkennen. Es ist daher ein idealer Ansatz für die Bestätigung mutmaßlichen Wechselwirkungen von Hefe-Zwei-Hybrid-oder Massenspektrometrie Proteomik Studien vorgeschlagen, und außerdem ist es gut geeignet für die Zuordnung der Interaktion Regionen, die den Effekt von post-translationalen Modifikationen auf Protein-Protein-Wechselwirkungen und Bewertung der Auswirkungen von Mutationen in Patienten-DNA identifiziert.

Einleitung

Sowohl klassische Verknüpfung und Next-Generation-Sequencing-Analysen von menschlichen Erkrankungen werden enthüllt die klinische Bedeutung von Proteinen in einer Reihe von biologischen Stoffwechselwegen beteiligt. Es ist oft der Fall, dass vor der Identifizierung in dieser Untersuchungen hat es wenig oder keine Untersuchung der biologischen Funktion dieser Proteine. Ein fruchtbarer Weg erkunden die biologische Funktion eines Proteins von Interesse zu beginnen, ist zu erkennen, welche anderen Proteinen interagiert es mit in seine physiologischen Kontext. Charakterisierung molekularer Netzwerke auf diese Weise Einblicke in die biologischen Signalwege des menschlichen Phänotyp zugrunde liegen.

Die am häufigsten verwendete Groß Screening Ansätze zur Identifizierung von Kandidaten-Interaktionspartner für Proteine ​​von Interesse sind ^{Hefe-Zwei-Hybrid-Screening-1} und Massenspektrometrie-basierte Proteomik ^2. Diese Methoden können in die eine mögliche interagierende Proteine ​​sehr erfolgreich sein, aber arE anfällig für falsch-positive Ergebnisse. Daher Bestätigung einer Interaktion von Hefe-Zwei-Hybrid-oder Massenspektrometrie Screening identifizierten erfordert Validierung der Interaktion mit einer zweiten Technik. Typischerweise wird eine Co-Immunfällung oder Pull-down-Assays für diesen Zweck ³ verwendet. Ein Nachteil der Verwendung derartiger Techniken zur Validierung der Anforderung zur Zelllyse, welche die intrazellulären Bedingungen, die für die Aufrechterhaltung bestimmter Protein-Wechselwirkungen sein können zerstört. Ein zweiter Nachteil ist, dass schwache oder transiente Protein-Interaktionen während der Waschschritte kann gestört werden. Darüber hinaus sind diese Assays verlangen bedeutende praktische Zeit werden in der Anzahl der Proben, die gleichzeitig verarbeitet werden kann, begrenzt, und oft zeitaufwändige Optimierung von Reagenzien und Protokollen.

Um einige der Probleme, mit Co-Immunopräzipitation Experimente zu überwinden, wurden mehrere Assays, die auf Fluoreszenz-und biolum entwickeltinescent Proteine, die in lebenden Zellen verwendet werden kann. Die ersten dieser Tests wurden auf Fluoreszenz (oder Förster) Resonanzenergietransfer (FRET), die nicht-strahlende Energieübertragung zwischen zwei fluoreszierende Proteine ​​mit überlappenden Emissions-und Anregungsspektren ⁴ basiert. Die Effizienz der Energieübertragung ist stark abstandsabhängig, also die Beobachtung des FRET Phänomen erfordert, dass die Donor-und Akzeptor-Fluorophore in unmittelbarer Nähe sein. Und die zweite als eine Fusion mit dem Akzeptor-Fluorophor (üblicherweise gelb fluoreszierendes Protein, YFP), um eine Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen von Interesse zu testen, wird ein Protein als Fusion mit dem Donor-Fluorophor (GFP allgemein cyan fluoreszierendes Protein) ausgedrückt. Eine Interaktion zwischen den beiden Proteinen von Interesse kann die Donor-und Akzeptor Fluorophore nahe genug für die Energieübertragung auftreten zu bringen, was zu einer messbaren Erhöhung der Emission von Licht aus dem Akzeptor YFP bezogen auf die GFP Spender führen wird. FRET wurde im Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen ⁴ erfolgreich. Der Hauptnachteil der Verwendung von FRET zur Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen ist die Voraussetzung für eine externe Beleuchtung zur Anregung des Donor-Fluorophors. Aussenbeleuchtung zu hohen Hintergrund in der Emissionssignal, unerwünschte Anregung des Akzeptor und Bleichen von Spender-und Akzeptor-Fluorophore. Diese Effekte verringern die Empfindlichkeit des Assays zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen.

Eine Veränderung des FRET-Assay, der das Problem der hohen Hintergrund von externen Beleuchtungswindet die Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET)-Assay ^5,6. Im BRET-System der Donor-Fluorophor durch eine Luciferase-Enzym ersetzt. Somit ist die Energie für die Anregung des Akzeptor-Fluorophors in dem System durch die Oxidation eines Luciferase-Substrat erzeugt, der eine externe Beleuchtung notwendig. In der am meistenallgemeine Konfiguration dieses Assays ist die Spender Renilla reniformis-Luciferase und der Akzeptor YFP (für eine Diskussion der alternativen Donor-und Akzeptor-Proteine ​​siehe Pfleger et al. ^5). Dementsprechend wird in diesem System ein Protein von Interesse an Luciferase und einem potentiell interagierenden Protein YFP oder umgekehrt fusioniert. BRET-Assay erfordert die Zugabe von Coelenterazin als Substrat für Luciferase. Da Coelenterazin zellpermeables, ist es möglich, BRET-Assays mit lebenden Zellen durchzuführen. Jedoch ist natives Coelenterazin in wässriger Lösung instabil, und das Enzym-unabhängigen Abbau von Coelenterazin sowohl die Konzentration von Substrat für den Test zur Verfügung und erzeugt Autolumineszenz, die die Empfindlichkeit der Messung der Luciferase-Aktivität reduziert. Die Verwendung von BRET in lebenden Zellen wurde durch die Entwicklung von Schutz Coelenterazine, die in wässriger Lösung stabil sind, aber durch cytosolische Esterase erleichterts nach der Diffusion durch die Zellmembran zum aktiven Coelenterazin in die Zelle ⁷ zu erzeugen.

Nach der Zugabe von Substrat zu Zellen Luciferase-und YFP-Fusionsproteine ​​exprimieren, wird die Energieübertragung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, die zu durch Überwachung der Emission von Luciferase und YFP quantifiziert. Weil Protein-Wechselwirkungen direkt in lebende Zellen in Multi-Well-Platten beobachtet werden, stellt die BRET-Untersuchung eine einfache, skalierbare Verfahren zur Validierung putative Wechselwirkungen, kosten-und zeiteffizient ist.

Neben der Validierung putativen Interaktoren in Proteom-Screening Studien identifiziert, kann das BRET-System auch Testkandidat Interaktoren, die aus dem Stand der biochemischen und strukturellen Studien zu dem Protein von Interesse verwendet werden. Nachdem das Vorliegen einer Protein-Protein-Wechselwirkung (entweder unter Verwendung des BRET-Assays oder durch andere Verfahren) hergestellt wurde, gibt es ein Potential für die BRET-Untersuchung zu emp seinLoyed weiter, um die Interaktion zu charakterisieren. Zum Beispiel können die zusammenwirkenden Bereiche durch Erzeugen stumpf Versionen der Proteine ​​abgebildet werden, und die Beteiligung von spezifischen Resten in der Interaktion kann durch die Schaffung von Punktmutationen nachgewiesen werden. Weiterhin kann die modulatorische Wirkung von posttranslationalen Modifikationen oder kleine Moleküle (z. B. Drogen oder Liganden) an Protein-Protein-Wechselwirkungen untersucht werden ^8-10.

BRET-Assay hat auch ein großes Potenzial für die Untersuchung von Mutationen in Patienten-DNA identifiziert. In Fällen, wo eine ursächliche Rolle für eine Mutation festgestellt wurde, die Untersuchung der Wirkung der Mutation auf die Protein-Protein-Interaktionen mit BRET kann mehr über die molekularen Ätiologie des Phänotyps ¹¹ offenbaren. Seit dem Aufkommen von Sequenzierungsmethoden der nächsten Generation, ist es zunehmend üblich, mehrere potentiell schädlichen Mutationen in einer einzelnen identifiziert werden, in welchem ​​Fall es nicht klar, welche rele sindvant mit dem Phänotyp ^12. In dieser Situation kann der BRET-Untersuchung wertvoll bei der Bewertung der Auswirkungen der Mutationen auf die Proteinfunktion und damit ihre Bedeutung für die Erkrankung.

Protokoll

1. Erstellung der Plasmide

1. Subklonierung der cDNA für jedes Protein von Interesse in sowohl den pLuc und pYFP Vektoren unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken (Abbildung 1). Für detaillierte Protokolle siehe Green et al ^13.
2. Sequence alle Konstrukte, um zu überprüfen, dass die Proteine ​​von Interesse sind im Rahmen mit dem Luc / YFP-Sequenz ohne dazwischen Stop-Codons.
3. Funktionstests durchzuführen, wie gewünscht, um zu bestätigen, daß die Fusionsproteine, die biologische Aktivität beibehalten. In dem hier vorliegenden Fall wurde die subzelluläre Lokalisation von YFP Fusionsproteine ​​mittels Fluoreszenzmikroskopie ermittelt.
4. Machen Expressionsplasmide für entsprechende Luc und YFP Kontrollproteinen durch gentech die relevanten Targeting-Signale in den pLuc und pYFP Expressionsvektoren. In dem hier vorgestellten Fall erzeugen Kernziel Luc und YFP-Konstrukten durch Einfügen eines Kernlokalisationssignal in die pLuc pYFP und Vektoren.
5. Macheneine positive Kontrolle, in der Luc-Konstrukt und YFP zu einem einzigen Polypeptid fusioniert. In dem hier dargestellten Fall erzeugen eine positive Kontrolle, bei der die YFP-kodierenden Sequenz in den Vektor eingefügt pLuc.
6. Wähle einen neutralen Füllstoff-Plasmid verwendet werden, um die Masse der DNA-Transfektion in Mischungen auszugleichen. Verwenden ein Plasmid, das keine eukaryotischen Promotor und daher transkriptionell inaktiv in Säugerzellen, wie beispielsweise einer bakteriellen Clonierungsvektor.

2. Herstellung von DNA-Mischungen

1. Schätzung der Konzentration aller in Abschnitt 1 auf der Basis der Absorption bei 260 nm beschriebenen Plasmide (1 Absorptionseinheit beträgt 50 ug / ml DNA). Bestimmung der Molekülmasse von jedem Plasmid durch Multiplizieren der Anzahl von Basenpaaren von 650 Da. Verwenden der Konzentration und Molmasse, um die molare Konzentration der einzelnen Plasmid-Präparation zu berechnen. Verdünne die Plasmid-DNA-Präparationen in einer Konzentration von 36 nM. Diese werden die Arbeitsvorräte werdendas wird verwendet, um die DNA-Mischungen für die Transfektion vorzubereiten.
2. Vorbereitung einer Kontroll-DNA-Gemisch, das 1,800 ng Plasmid-Füllstoff in einem Endvolumen von 20 &mgr; l Wasser.
3. Bereiten Sie eine Kontroll-DNA-Mix mit 5 ul der pLuc-Kontrollkonstrukt. In Füllstoff Plasmid-DNA, die Gesamtmasse bis 1.800 ng zu bringen. Fügen Sie Wasser, um das endgültige Volumen auf 20 ul zu bringen.
4. Bereiten Sie eine Kontroll-DNA-Mix mit 5 ul pLuc-Kontrollkonstrukt und 5 ul pYFP-Kontrollkonstrukt. In Füllstoff Plasmid-DNA, die Gesamtmasse bis 1.800 ng zu bringen. Fügen Sie Wasser, um das endgültige Volumen auf 20 ul zu bringen.
5. Bereiten Sie eine Kontroll-DNA-Mix mit 5 ul der positiven Kontrolle Konstrukt. In Füllstoff Plasmid-DNA, die Gesamtmasse bis 1.800 ng zu bringen. Fügen Sie Wasser, um das endgültige Volumen auf 20 ul zu bringen.
6. Bereiten Sie die folgenden DNA mischt, um für die Homodimerisierung eines Proteins von Interesse, X. Test für jede DNA-Mischung kombiniert 5 ul der entsprechenden pLuc konstruieren und 5 ul des pYFP zu konstruieren. In Füllstoff Plasmid-DNA, die Gesamtmasse bis 1.800 ng zu bringen. Fügen Sie Wasser, um das endgültige Volumen auf 20 ul zu bringen.
   A) pLuc-Steuerung und pYFP-X
   B) pLuc-X und pYFP-Steuer
   C) pLuc-X und-X pYFP
7. Bereiten Sie die folgenden DNA vermischt, um eine Wechselwirkung zwischen einem Paar von Proteinen von Interesse zu testen, X und Y für jede DNA-Mischung kombiniert 5 ul der entsprechenden pLuc konstruieren und 5 ul der pYFP konstruieren. In Füllstoff Plasmid-DNA, die Gesamtmasse bis 1.800 ng zu bringen. Fügen Sie Wasser, um das endgültige Volumen auf 20 ul zu bringen.
   A) pLuc-Steuerung und pYFP-X
   B) pLuc-X und pYFP-Steuer
   C) pLuc-Steuerung und pYFP-Y
   D) pLuc-Y und pYFP-Steuer
   E) pLuc-X-und-Y pYFP
   F) pLuc-Y und X-pYFP

3. Transfektion

1. Ernte subkonfluenten HEK293-Zellen aus einem 75 cm ^2-Kolben. Verdünnte 10% der gesamten Zellen in 13 ml Kulturmedium. Dispense 130 ul Zellsuspension in jede Vertiefung einer weißendurchsichtigem Boden 96-well Gewebekulturplatte. Kulturzellen für 24 Stunden.
2. Berechnung der Anzahl der Vertiefungen durch Multiplikation der Anzahl der DNA-Mischungen von 3 transfiziert werden. Bringen serumfreiem Kulturmedium auf Raumtemperatur. Erstellen Sie einen Master-Mix mit 6,3 ul Serum-freien Medium und 0,18 ul Transfektionsreagenz pro Vertiefung. Durch Vortexen mischen und bei Raumtemperatur für 5 min.
3. Bereiten Transfektion Mischungen durch Zugabe von 2 ul DNA-Mix auf 20 ul Serum-freien Medium / Transfektionsreagenz Master-Mix. Nicht mit dem Vortex. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min.
4. Transfektion von drei Brunnen mit jeder Transfektion Mix Abgabe 6,5 ul Transfektionsmischung pro Vertiefung. Kultur die Zellen für weitere 36 bis 48 Stunden.

4. Messung von BRET-Signal

1. Auflösen lebenden Zellen Luciferase Substrat bei 34 mg / ml in DMSO durch Vortexen.
2. Verdünnen wiederhergestellt Lebendzell-Luciferase-Substrat bei 1:1000 in Verdünnungsmedium Substrat pauf 37 ° C wieder erwärmt, Lassen Sie 50 ul Substrat Verdünnungsmedium pro Vertiefung. Vortex mischen. Ein Niederschlag bilden kann, aber nicht mit dem Assay interferieren.
3. Absaugen Kulturmedium aus der 96-Well-Platte. Geben Sie 50 ul verdünnte Lebendzell-Luciferase-Substrat in jede Vertiefung. Kulturzellen für mindestens 2 Stunden (bis zu 24 h).
4. Nehmen Sie den Deckel von der 96-Well-Platte und Inkubation der Platte für 10 Minuten bei Raumtemperatur in dem Luminometer.
5. Messen von Emissions Luc und YFP eine gut zu einem Zeitpunkt. Messen Emission von Luc mit einem Filter blockieren Wellenlängen größer als 470 nm ist. Messen von Emissions YFP Verwendung eines 500-600 nm Bandpass-Filters. Integrieren Emissionssignale über 10 sek.

5. Data Analysis

1. Mittelwert der Luc Emissionswerte von den 3 Brunnen, die nur den Füllstoff Plasmid erhielt. Subtrahieren Sie diesen Wert von allen anderen Luc Emissionswerte, die Hintergrund-subtrahiert Luc Emissionswerte zu erzeugen.
2. Mittelwert der YFP Emissionswerte von den 3 Brunnen, die nur den Füllstoff Plasmid erhielt. Subtrahieren Sie diesen Wert von allen anderen YFP-Emissionswerte, die Hintergrund-subtrahiert YFP-Emissionswerte zu erzeugen.
3. Für jeden gut, teilen Sie die Hintergrund-subtrahiert YFP-Emissionswert durch den Hintergrund-subtrahiert Luc Emissionswert um den unkorrigierten BRET-Verhältnis geben.
4. Mittelwert der unkorrigierten BRET-Verhältnisse aus den drei Brunnen, die nur mit dem pLuc-Kontroll-Plasmid transfiziert wurden. Subtrahieren Sie diesen Wert von allen anderen unkorrigierten BRET-Verhältnisse, um die korrigierten BRET-Verhältnisse zu geben.
5. Für jeden der verbleibenden Sätze von korrigierten BRET-Verhältnisse, der Mittelwert der Werte aus den drei Vertiefungen transfiziert, um eine endgültige BRET-Verhältnis zu erhalten.

Ergebnisse

Das Prinzip der BRET-Untersuchung ist in Fig. 2 dargestellt. Assay-Setup in den hier vorgestellten Experimenten verwendet, ist in Fig. 3 dargestellt. Die Erfassung eines starken BRET-Signal von Zellen mit einem Luciferase-YFP Fusionsprotein transfiziert bestätigt, dass die Energieübertragung zu beobachten war in dieser Versuchsanordnung (Fig. 4).

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Rolle der Familie von FOXP Transkriptionsrepressore...

Diskussion

Die Konstruktion der Fusionsprotein-Expressionskonstrukte ist ein kritischer Schritt bei der Einrichtung der BRET-Untersuchung. In den hier vorgestellten, wurden die Proteine ​​von Interesse an den C-Terminus von Luciferase oder YFP fusioniert. Es ist auch möglich und kann notwendig sein, um Proteine ​​an dem N-Terminus von Luciferase / YFP verschmelzen. Bei einigen Proteinen Fusionen können entweder nur an den N-oder C-Terminus um eine Unterbrechung der Proteinstruktur und-funktion zu vermeiden akzeptiert. Au...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanodrop 8000	Nanodrop		Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96-microwell plates, flat bottom, white	Greiner Bio One	655098	White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software	TECAN		Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.
pLuc, pYFP, positive control plasmid	N/A	N/A	Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells	ECACC	85120602	Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red	Gibco	41966	This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)	Gibco	21063	This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum	Gibco	10270	For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent	Novagen	70967	If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO	Sigma	D2650	Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.
EnduRen live-cell substrate	Promega	E6481	Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.