Phosphopeptid Analyse der Nebenhoden Nagetier Spermien

Zusammenfassung

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO₂.

Zusammenfassung

Spermien sind ziemlich einzigartig unter den Zelltypen. Obwohl in den Hoden produziert werden beide Kern Gentranskription und Translation augen, wenn der Vorläufer-Knopfzelle beginnt, sich zu verlängern und differenzieren, was morphologisch als Samenzelle erkannt geschaltet. Jedoch ist das Spermium sehr unreif, da sie keine Möglichkeit für die Motilität oder Eiererkennung. Diese beiden Ereignisse auftreten, sobald die Spermien Transit eine sekundäre Organ als Nebenhoden bekannt. Während der ~ 12 Tage Passage, die es dauert, bis eine Samenzelle, durch den Nebenhoden übergeben, post-translationale Modifikationen bestehender Proteine ​​spielen eine zentrale Rolle bei der Reifung der Zelle. Ein wesentlicher Aspekt solcher ist Proteinphosphorylierung. Um Phosphorylierung Ereignisse während Spermienreifung stattfindet zu charakterisieren, müssen sowohl reine Samenzellpopulationen und Pre-Fraktionierung von Phosphopeptiden eingerichtet werden. Mit Rückspülung Techniken, ein Verfahren zur Gewinnung von reinem Spermien of hohe Qualität und Ausbeute der distalen oder Schwanznebenhoden skizziert. Die Schritte zur Solubilisierung, Verdauung und Vorfraktionierung von Spermien Phosphopeptide durch TiO ₂ Affinitätschromatographie erläutert. Nachdem sie isoliert wurde, kann Phosphopeptide in ein MS eingespritzt werden, um beide Protein Phosphorylierungsereignissen spezifischen Aminosäurereste während der Spermareifung Prozesse zu identifizieren und zu quantifizieren, die Niveaus der Phosphorylierung stattfindet.

Einleitung

Nachdem aus dem Hoden entstanden, sind Spermien stark dennoch bemerkenswert unterscheiden, sind diese Zellen unreife ^1,2. Als solcher, fehlt ihnen die Funktionalität, einschließlich der Fähigkeit zu schwimmen und zu binden, um eine Eizelle ^3. Obwohl weitere Reifung der Samenzelle erforderlich ist, kann dies nicht mittels kanonischer Routen stattfinden, da in diesem Stadium ihrer Zelldifferenzierungsprozesses, unfähig Gentranskription und ferner Proteinbiosynthese ⁴ sind. Biologische Kompetenz basiert auf Spermien übertragen als sie aus dem Hoden und geben Sie einen Teil der männlichen Geschlechtsorgane als Nebenhoden ⁵ bekannt. Der Nebenhoden ist ein eng gewickelten, hoch differenzierte Rohr, das die Ausführungsgänge (der Hoden) wird an der Samenleiter und ist in allen männlichen Säugetieren ⁶ vorhanden. Spermien schrittweise ihre Düngepotential während Nebenhoden Abstieg zu erwerben, die sich auf die sich ständig verändernden Umgebung, die Lumen crvon den lokalen Nebenhoden Epithelzellen ⁷ eated. Die verschiedenen sekretorischen und wieder aufnahme in der Nebenhoden Milieu Akt gegenwärtigen Aktivitäten der Spermien selbst zu verändern, Änderung seiner Protein-, Kohlenhydrat- und Lipidzusammensetzung ^6. Die Bedeutung der Nebenhoden, insbesondere die anfängliche "caput 'Bereich dieser Struktur wurde mit chirurgischen Ligationstechniken ⁸ veranschaulicht. Spermien im Hoden von Ausführungsgang Ligation erhalten fehlen völlig in irgendeiner Eigenschaft, um die Eizelle zu befruchten ^9-11.

Zusätzlich zu den Nebenhoden Umwelt, um Signalwege innerhalb der Spermien Arbeit posttranslational ändern Sie den vorhandenen Samenzelle ergänzen. Zum Beispiel, Spermien aus den frühen Regionen der Epididymis die unterschiedliche Muster der Protein-Phosphorylierung im Vergleich zu den letztgenannten Regionen ^5,12. Dies ist nicht überraschend, da es große Unterschiede in der capability der Spermien aus diesen Regionen. Zum Beispiel Spermien aus dem frühen, caput Nebenhoden sind immotilite. Im Gegensatz dazu werden Samenzellen von der Cauda Region nach vorne durchlaufen progressive Motilität einmal in isotonischen Medium platziert. Da Nebenhoden Samenzellen nicht in der Lage de-novo Proteinbiosynthese sind, müssen alle intrinsischen Weg der Regulierung Spermienfunktion durch post-translationale Modifikationen (PTM) sein. Daher liegt es nahe, dass die Proteomik Vernunft, insbesondere die Untersuchung der PTMs wie Phosphorylierung muss eine große Schubkraft, wenn wir Spermienreifung verstehen.

Eine alternative Methode, um Spermien aus den epididymidies erhalten zu bedienen Retro-Rückspülung ^13-16. Obwohl diese Technik sicherlich zeitaufwendig und nimmt einen höheren Grad der Geschicklichkeit der Bedienungsperson, erhalten die Spermatozoen Reinheit von über 99,99% zeigen durchweg. Zusätzlich, im Gegensatz zu allen anderen Techniken Spermatozoen can in einem Ruhezustand isoliert werden, wodurch es möglich zu untersuchen, wie die Beweglichkeit der Spermien wird eingeleitet. Als Probenvorbereitung ist der wichtigste Aspekt für die Proteomanalyse, Isolierung der Spermien hat sich zu einer der wichtigsten Aspekte der Spermien-Proteom-Studien. Dieses Protokoll sieht eine Erklärung wie Spermien aus dem Nebenhoden Cauda isoliert. Im Anschluss daran wird die TiO ₂ Phosphopeptidanreicherung Verfahren dargelegt, mit spezieller Bezugnahme, wie Peptide, die von den hochdifferenzierten Spermien gewinnen. Die MS-Ansatz kann verwendet werden, um wechselnde Phosphopeptide zu unterscheiden wenn man die Nebenhodenschwanz Spermatozoen in einem Zustand zu vergleichen (unbeweglich oder Nicht kapazitierten) zu einem anderen (beweglich, kapazitierten, Akrosom reagierte, etc.) so dass dies ein leistungsfähiges Konzept für Spermien zu untersuchen Funktion.

Protokoll

1. Vorbereitung der Kultur, Medien und Gerichte

1. Make 200 ml Biggers Whitten und Whitten (BWW) ¹⁷ Arbeitslösung durch Zugabe von 5,54 g NaCl, 0,356 g KCl, 0,25 g CaCl _2, 0,162 g H ₂ KO ₄ P und 0,294 g MgSO ₄ zu 1 l Milli-Q-Wasser . Dies ist der Stammlösung und kann bei 4 ° C für bis zu einem Monat aufbewahrt werden.
2. Aus der Stammlösung hinzufügen 420 mg NaHCO ₃ ^-, 200 mg Glucose, 6 mg Natriumpyruvat, 600 mg Rinderserumalbumin, 0,74 ml Natriumlactat und 4,0 ml HEPES-Puffer auf 193 ml der BWW Lager. Dies ist der Arbeitslösung und wird immer frisch am Tag hergestellt und vor der Verwendung auf 37 ° C äquilibriert.
3. Um die Kanüle zu machen, nehmen Polyethylen (PE) Schlauch mit einem Innendurchmesser von 0,4 mm und einem Außendurchmesser von 1,1 mm und halten geringer Hitze (typischerweise Methanol Flamme), so daß der Schlauch zu schmelzen beginnt. Den Schlauch sofort OutW ziehenard zu strecken und machen den Außendurchmesser enger.
4. Geschnitten, um eine Verengung der ein Ende, das für eine einfachere Kanülierung des Vas deferens ermöglicht herzustellen.
5. Schneiden des anderen Endes der Kanüle auf etwa 15 cm. Legen Sie eine 30 G Nadel in dem stumpfen Ende und befestigen Sie eine 3-ml-Spritze, um sie (ganz eingefahren).
6. Machen Sie eine Saugmundstück durch Schneiden einer 20 cm Länge der PE-Schlauch (4,2 mm Innendurchmesser, 6,4 mm Außendurchmesser). Legen Sie ein Mundstück in ein Ende.
7. Setzen Sie den Mikro Glaskapillare Halter und den Glas Mikrokapillare selbst (typischerweise 3 & mgr; l für eine Maus 40 ul für eine Ratte).

2. Entfernung von Nebenhoden von Maus

1. Euthanize Mäusen nach IACUC zugelassene jedem Organ Verfahren.
2. Nehmen Sie die Tier- und machen einen kleinen Schnitt in den Hodensack, die Nebenhoden aussetzen. Ziehen Sie die Hoden und Nebenhoden aus dem Hohlraum mit einem Paar Uhrmacher # 5 Pinzette.
3. Schneiden der Samenleiter, so dass wenigstens 1-2 cm bleiben der Cauda epididymis befestigt. Darüber hinaus schneiden die proximalen Ausführungsgänge und Gewebe Anschluss der Nebenhoden in die Hoden und nehmen Sie das gesamte männliche Fortpflanzungsspur.
4. Legen Sie die gesamte männliche Fortpflanzungsspur unter einem Binokular mit einem Vergrößerungsbereich in der Reihenfolge der 5-40X.

3. Kanülieren des Nebenhoden

1. Band entlang der Kanüle zum Mikroskop, so dass 1-2 cm von der Einschnürung (kegelförmigen) Ende frei ist und durch die Linse sichtbar.
2. Nehmen Sie ein Paar Uhrmacher # 5 Pinzette und sanft umklammern jede Seite der Samenleiter und der Samenleiter zu ziehen auf die Kanüle, so dass die Kanüle in der Samenleiter geht.
3. Nehmen Sie eine Länge von nicht-resorbierbaren geflochtenen schwarzen behandelt Seide (Größe 5-0) und einen Knoten um die Kanüle eingeführt Samenleiter. Stellen Sie sicher, der Knoten ist eng gezogen, um die Kanüle in den Samenleiter zu halten, wenn Luftdruck from die Spritze angewendet wird.

4. Retrograde oder Rückspülung von Caudal Nebenhoden Spermatozoen

1. Mit Uhrmacher # 5 Zange greifen das distale Ende der cauda Nebenhoden und entfernen Sie die Tunica albuginea, um eine einzelne Nebenhoden Röhrchen aus.
2. Mit der Zange, ziehen Sie die Röhrchen aus, um freizulegen und dann zu necken auseinander, um eine Öffnung zu schaffen für die Spermien freigegeben werden.
3. Drücken Sie vorsichtig auf die 3 ml (Maus) oder 20 ml (rat) Spritze, um Luft aus der Spritze in den Samenleiter zu vertreiben. Bei entsprechenden Druck- wird Spermatozoen beginnt langsam aus dem zerbrochenen Röhrchens am distalen Ende der Cauda epididymis kommen. Zu diesem Zeitpunkt wird unter Absaugen des Mundstücks, um die Spermien in der Glaskapillare ziehen. Anmerkung: In der Regel in einer Maus, kann 2-3 ul von Spermatozoen in Abhängigkeit von dem Alter des Tieres erhalten werden. Eine Ratte Willen, am Durchschnittsertrag von 30 bis 40 & mgr; l.

5. Waschenund Lyse der Spermatozoen in Vorbereitung für Proteomics

1. Vertreibt die Spermien von der Glaskapillare in 1 ml-Lösung von BWW-Lösung (37 ° C) durch sanft weht in das Mundstück oder Anbringen einer Spritze und Ausstoßen von Luft, um die Spermien wieder aus der kapillaren schieben.
2. Sobald die Samenzellen diffundiert, waschen 3x (300 × g, 5 min) mit 1 ml BWW um kontaminierende Proteine ​​zu entfernen. Nach dem letzten Waschen, entfernen Sie den Überstand. Anmerkung: Zu diesem Zeitpunkt können die Spermien für eine spätere Verwendung eingefroren werden.
3. Solubilisierung von Proteinen unter Verwendung von 4% CHAPS, 2 M Thioharnstoff, und 50 mM Tris, pH 7,4 für 1 h mit intermittierendem Vortexen.
4. Nach Lyse der Zellen, Zentrifuge (10.000 × g, 20 min), nehmen Sie Standes und Überführung in ein neues Röhrchen. Anmerkung: An diesem Punkt kann die Proteinquantifizierung durchgeführt werden.

6. Disulfidbrücke Reduktion und Alkylierung

1. Als Endkonzentration hinzufügen 10 mM DTT zu lysierenden Proteine, vortex und Inkubation bei RT für 30 min.
2. Idodoacetamide als Endkonzentration Lysat Vortex 50 mM und Inkubation bei RT für 30 min im Dunkeln.

7. Niederschlag

1. Methanol Chloroform auszufällen die Probe durch Zugabe von 1 Volumen-Lysat (400 & mgr; als ein Beispiel), fügen ein Volumen (400 ul) Methanol und 0,5 Volumen (200 ul) Chloroform.
2. Vortex die Probe und Spin (10.000 × g, 2 min).
3. Beachten Sie, dass zwei Phasen wird nach der Zentrifugation angezeigt. Entsorgen Sie alle aber 2 mm von der Deckschicht (darauf achten, daß die Schnittstelle zu stören).
4. 1 Volumen (400 ul) Methanol, vorsichtig invertieren 1-2x Rohr zu mischen und wieder drehen (10.000 × g, 15 min). Überstand verwerfen zu verlieren und an der Luft trocknen Pellet für 3-4 min.

8. Trypsinverdau

1. Rekonstituieren Trypsin in 25 mM Ammoniumbicarbonat, enthaltend 1 M Harnstoff in einem Verhältnis von 50: 1 (W / W; Protein: Trypsin) und inkubiert Overnight bei 37 ° C, vorzugsweise bei 700 rpm auf einem Thermomixer.
2. Spin (10.000 × g, 15 min), um unverdaute Material zu pelletieren. Überstand in neues Röhrchen.

9. Phosphopeptidanreicherung

1. Führen Reinigung und Anreicherung von Phosphopeptiden aus dem tryptischen Verdaus, wie zuvor beschrieben ^18. Verdünne tryptischen Peptide 10-fach in DHB-Puffer [DHB Puffer besteht aus: 350 mg / ml 2,5 dihydrobenzesulfonic Säure (DHB), 80% (v / v) ACN (Acetonitril), 2% (v / v) TFA (Trifluoressigsäure Säure)] und auf Trocken TiO ₂ Perlen (200 ug).
2. Lassen Sie auf einem Schüttler bei Raumtemperatur für 1 Std.
3. Die Probe mit DHB-Puffer waschen, drehen und entfernen Überstand. Dann waschen Sie die Probe dreimal mit Waschpuffer [80% ACN (V / V), 2% TFA (v / v)], um den DHB entfernen.
4. Nach dem letzten Schleudern unmittelbar eluieren Phosphopeptide mit Elutionspuffer durch Zugabe von 25 ul einer 2,5% Ammoniumhydroxid, pH ≥ 10,5 Lösung. SStift und Überstand. Sofort mit ~ 0,3 ul Ameisensäure zu neutralisieren.

Ergebnisse

Die Qualität der Ergebnisse von jedem Proteomanalyse ist stark abhängig von dem Ausgangsmaterial. Mit modernen MS werden leichte Verschmutzungen in Probenvorbereitungen leicht nahm. Daher ist es kritisch, im Falle von Spermium Proteomik, die Bereitstellung eines Verfahrens, das hochreine Spermien gibt wählen. Wie in Figur 1 dargestellt ist, wird retrograd Rückspülung verwendet, um Spermien der Cauda epididymis aus abzurufen. Dies beinhaltet Kanülieren der Samenleiter mit PE-Schlauch, der ein bis langsam Luftdruck aus der Spritze befestigt gelten können. 1A zeigt die Cauda Nebenhoden zusammen mit den Samenleiter. 1B ist eine Nahaufnahme, wie die Samenleiter gebunden ist, wo die Kanüle eingesetzt ist. Dabei, so, Spermatozoen im exzidiert Ende eines Röhrchens aus den Schwanzhoden freigesetzt. Wie in 2A gezeigt, werden die Spermien von den Scheitelbereichen der caud extrahiertenein Nebenhoden und werden in eine Glaskapillare in einem Ruhezustand (Figur 2B) angesaugt wird. Dies hat mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen "swim-up" -Verfahren, von denen nicht zuletzt die Möglichkeit, eine Analyse der phoshoproteomic Spermien vor und nach der Aktivierung der Beweglichkeit führen. Die Spermien können dann in Medien seiner Wahl ausgeschlossen werden. 2C (links) zeigt, wie die Spermien sofort kümmern Vertreibung in BWW Medien. Viele der Zellen verklumpten. Es wird jedoch nach 10 Minuten die Kompetenz der Zellen gezeigt, weil sie schwimmen, um die Homogenität in die Lösung (2C, rechts Zellen). Da die Rückspülung Technik hat sehr wenig Einfluss auf die Samenzellen, so erhält man in der Nähe von 100% Beweglichkeit und die Zellen verteilen sich schnell in die Medien ohne externe Provokation. In einem typischen Experiment Rückspülung, Sperma erholte sich von der Swiss-Maus enthältzwischen 1-5 x 10 ⁶ Zellen. Diese ist stark abhängig von dem Alter des Tieres und kann aus verschiedenen Mäusestämmen variieren. In einer norwegischen Ratte, wir in der Regel erhalten, 200 x 10 ⁶ Spermien, ± 20%. 2D steht für die Reinheit der Spermien aus dem Nebenhoden der Ratte Cauda erhalten.

Neben der Probe selbst, ist eine der wichtigsten Fragen im Zusammenhang mit der Probenvorbereitung die Ausbeute an Trypsinverdau. Proteinfällung spielt eine wichtige Rolle nicht nur bei der Entfernung von unerwünschten Detergentien und Salze, die beide mit MS nicht kompatibel sind, sondern auch in Proteine ​​zu denaturieren. Wir haben die Methanol-Chloroform Fällung am besten zu funktionieren gefunden. Nicht nur, dass diese Vorgehensweise wurde berichtet, dass geringe vorkommenden Proteine ​​besser als andere mit TCA-Fällung ¹⁹ zu fällen, aber es zusätzliche Vorteile hat. Folgende TCA-Fällung, ist es oft notwendig, den pH-Wert nach der Aussetzung des TCA-Pellet, die ganz bleibt korrigieren könnensauer. Obwohl das ausgefällte Pellet von TCA in hohen organischen Lösungen gewaschen, um die Säure zu entfernen, fügt dieser die Handhabung und Nichtreproduzierbarkeit der Ergebnisse abzutasten. Bei Nichtbeachtung der Säure zu neutralisieren wird in armen tryptischen Peptidausbeuten. Methanol-Chloroform Fällung ist nicht nur schnell, aber nicht die Probe zu säuern. Abbildung 3 zeigt die Proteinpellet der Regel von 100 ug Probe zwischen der unteren und der oberen Zwischenphase zu sehen.

Die Isolierung der Phosphopeptide können in einer Reihe von Arten erfolgen; jedoch Reproduzierbarkeit davon abhängig, wie die Probe wurde bis zu handhaben und mit diesem Zeitpunkt. Eines der häufigeren, Entwicklungsverfahren ist TiO _2, die ursprünglich von der Gruppe von Martin Larsen ^18,20,21 entwickelt. Obwohl als ein Prozess in Mikrosäulen verwenden beschrieben, können wir reproduzierbare Daten zu erhalten, mit der Batch-Chromatographie. Der Erfolg des Prozesses ist stark abhängig von dem Elutionspuffer, welche verrückt sein muss e mit der richtigen Zusammensetzung; andernfalls Phosphopeptide haupt nicht eluiert.

Die Reproduzierbarkeit der Protokoll und repräsentative Daten aus TiO ₂ angereichert Phosphopeptiden aus Nebenhodensperma in einem unbeweglichen (Abbildung 4 oben) und beweglichen (Abbildung 4 unten) Zustand von m / z 650 bis 670 kann sehen. Wir haben gezeigt, daß dies eine äußerst reproduzierbare Technik auch bei Verwendung von biologischen Replikaten ^17. Die blauen Streifen über der Zeit erscheinen, sind Peptide Elution aus einer C18 Nanosäule als die Konzentration von Acetonitril zu. Offensichtlich im motile Population (n = 3 dargestellt ist, n = 8 laufen typischerweise), gibt es ein Peptid-Cluster mit einem monoisotopische Masse um die 651,5 Da Bereich, der in dem unbeweglichen Bereich völlig abwesend ist. Tandem-Massenspektrometrie wird dann verwendet, um dieses Peptid zu identifizieren.

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Abb. 1: Kanülierung der Cauda Nebenhoden (A) Bild von der Cauda Nebenhoden. Die Kanüle selbst ist unten mit Klebeband auf ca. 1-2 cm von der Pre-gezogen Ende aus. Dies wird mit feinen # 5watchmakers Pinzette in die Samenleiter eingesetzt ist. (B) Die Kanüle wird durch Binden feiner Seide um ein Segment, das sowohl die Samenleiter und die Kanüle gehalten. Aus der Maus, sind etwa 2-3 ul Schwanz epididymalen Zellen und Fluid in einer Konzentration von 1 x 10 ⁶ / & mgr; l gesammelt. Von der Ratte (dargestellt) werden etwa 30-40 & mgr; l Flüssigkeit in ähnlichen Konzentrationen erhalten.

Abbildung 2: verwendet, um kompetente Nebenhoden Samenzellen sammeln Glaskapillar-. (A) Ein Röhrchen von dem Scheitelpunkt der Cauda e pididymis ist isoliert und gebrochen. Die ungefähre Position aus dem dies geschieht, wird angezeigt. (B) Die oben im Bild zeigt ein leeres Glas Kapillare und die untere zeigt eine aus einer zuvor rückgespült Ratte. Es gibt keine Blutkontamination und minimale Epithelzelle Verunreinigungen. (C) Als der Spermien noch im Nebenhoden Fluidunverdünnt, werden sie nicht begonnen haben, zu aktivieren. Wenn die Samenzellen werden in einem BWW-Lösung vertrieben, kommen sie als kompakte "string" (linke Seite). Die Kompetenz der Zelle wird leicht feststellen, da nach 10 Minuten die meisten der Spermien schwimmen in Lösung ohne externe Störung (rechte Seite). (D) Ein Bild von einem aliquoten Teil der Schwanznebenhodenzellen unmittelbar nachdem sie verlassen, um zu schwimmen out zeigt die Reinheit der Zellen.

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Fig. 3: Methanol-Chloroform-Ausfällung Sobald Spermatozoen wurden solubilisiert, ist die lösliche Fraktion Methanol- Chloroform ausgefällt, um die Denaturierung der Proteine ​​und die Entfernung von kontaminierenden Stoffen zu gewährleisten. Das Protein Pellet wird in der Grenzfläche zwischen den Methanol / Wasser-und Chloroformphasen. Die obere Schicht wird sorgfältig entfernt, um nicht diese Pellet zu zerstören. Es ist üblich, etwa 2-3 mm von der oberen Phase zu verlassen, so daß kein Protein verloren geht.

Abb. 4: Typische TiO ₂ angereicherte Phosphopeptid Profil Mit dem beschriebenen Protokoll wurden Schwanznebenhoden-Spermien entweder immotile isoliert (oben, N = 3) oder bewegliche Staaten (unten, N = 3). Ein Peptid-Cluster mit einem Mono-Isotopenmasse von ~ 651,5 Da gezeigt, in den beweglichen Populationen vorhanden, aber völlig abwesend in den immotile diejenigen (Pfeil) zu sein. Vergleiche dieser Art werden als "markierungsfreie (MS-basiert)" bezeichnet. Die Peptidmasse und die Retentionszeit werden dann verwendet, um die Verbindung zum Tandemmassenspektrometrie zielen und zu identifizieren, die das Protein, von dem das Peptid abgeleitet wurde.

Diskussion

Die entscheidenden Schritte für eine erfolgreiche und reproduzierbare Proteomanalyse von Spermatozoen sind: 1) die Reinheit des Ausgangsmaterials; 2) Entfernung von unerwünschten Salzen und Detergenzien; 3) Denaturieren Proteinen in vollem Umfang um zu ermöglichen, Trypsin, eine hohe Ausbeute der Proteine ​​zu verdauen, und 4) die Probenhandhabung zu minimieren, um den Verlust von Peptid zu reduzieren.

Um die Cauda Nebenhoden erfolgreich rückmelden, ist es wichtig, den Bereich, aus dem der Spermien wird verlassen zu lokalisieren. Im Fall von Ratte und Maus, ist dies an dem Scheitel der konkaven Fläche, in der Mitte des kaudalen Bereich des Nebenhodens (siehe 2A). Wenn man weiter in Richtung auf den Vas deferens geht, ist Rückspülen erleichtert und die Erfolgsrate in der Regel höher. Allerdings geht dies zu dem Verlust der Spermienzahlen. Alternativ, wenn man versucht, auf den Korpus zu bewegen weiter proximal, dann ist die Menge an Druck erforderlich, um die Spermien durch den epididym zurückzudrängenal Kanäle oft so hoch, dass eine Beschädigung der Epididymis unweigerlich auftritt.

Rückspülen der Epididymis ist traditionell unter Verwendung von mit Wasser gesättigten Mineralöl und eine ausgeglichene Salzlösung in der Spritze selbst als ein Medium, um die Spermatozoen ^22-25 entfernen. Beide Verfahren sind potenziell problematische der LC-MS. Erstens ist Mineral wahrscheinlich die Nano-C18 Nano-Säulen, die im Grunde weltweit für Proteomanalyse und Pflege verwendet werden, müssen getroffen werden, damit keiner vorne in das Verfahren durchgeführt zu blockieren. Wenn dies auftritt, ist es unmöglich, weiter, und die Probe wird im wesentlichen verloren. Dies kann durch die Verwendung von BWW oder andere ausgeglichene Salzlösungen in der Spritze jedoch überwunden werden, auch wenn dies erfolgreich ist, wir bald erkannt, dass viele der Spermatozoen sich beweglich, sobald der BWW-Lösung in Kontakt kam, und der Schwanz epididymalen vermischt Zellen. Um dieses Problem zu umgehen, haben wir rückmelden Sie einfach die Spermien mit Luft. Nicht nur ist die Qualkeit von Spermatozoen vergleichbar mit der flüssig-basierten Methoden, aber die Menge ist identisch.

Phosphoproteomik ist vielleicht eine der wenigen Möglichkeiten, um festzustellen, welche Signalwege sind an Spermien nach der Ejakulation auftreten. Einer der Hauptwege wir untersuchen ist der Prozess der Kapazitation. Spermatozoen unterziehen müssen "Kapazitation", bevor sie in der Lage zur Bindung an ein Ei ist. In der Praxis wird dies im wesentlichen durch Inkubieren Spermatozoen für einen Zeitraum erreicht (; Ratte 1,5 h; Maus 40 min menschlichen 3-24 h) in BWW-Lösung mit Serumalbumin. Zuvor haben wir und andere eine Rolle für mehrere Kinasen in Kapazitation beteiligt gezeigt. Von Interesse, Deletion des PKA μ II herzustellen Mäusen, deren Spermien schwimmen in vitro spontan, können aber nicht die Hyperaktivierung ²⁶ zu unterziehen. Letzteres ist ein Markenzeichen der Kapazitation, wobei Spermien verändern ihre Schwimmmuster von hoher Geschwindigkeit und niedriger Amplitude, auf einen niedrigenGeschwindigkeit, schlagen hohe Amplitude Frequenz. Wir haben gezeigt, Downstream-Kinasen an diesem Prozess beteiligt sind pp60-Börsenaufsicht (SRC) ^13,27 c-ja ²⁸ und ^c-ABL-14. Interessanterweise Hemmung des SRC stoppt Kapazitation abhängigen Tyrosinphosphorylierung ^13. Dies kann jedoch mit Okadainsäure überwunden werden, was darauf hindeutet, dass SRC wird nicht direkt in der allgemeinen Einsetzen der Tyrosinphosphorylierung ²⁹ beteiligt ist, sondern kann eine Phosphatase ²⁹ regulieren. Das Problem bei der Verwendung BWW als Medium, um Spermien aus dem Nebenhoden zu zwingen ist, dass einmal aktiviert, Maus Spermien erst ca. 40 min zu befähigen. Da die Isolation von Spermatozoen 5 min / Maus und oft mehrere Mäuse werden in einem Experiment verwendet, so will Spermatozoen zu verschiedenen Reifestadien zu Beginn des Experiments. Um dies zu überwinden, kann Luftdruck verwendet, um die Spermien aus den Nebenhoden Schwanz in eine Glaskanüle zu drücken. Nicht nur sind die Spermien inactive und im Wesentlichen, wie sie in der Schwanz Milieu gefunden werden, macht es möglich, unbewegliche und bewegliche Phosphoproteomik vergleichen.

Probenhandhabung für Phosphoproteomik sollten auf ein Minimum beim Vergleich von Spermien in zwei verschiedenen Funktionszuständen gehalten werden. Die Verwendung von Methanol Chloroform gegenüber anderen traditionellen Methoden der Proteinfällung 1) verringert die Notwendigkeit für zusätzliche Waschschritte, 2) entfernt fast alle Spuren von Salzen und Fetten und 3) eine nachgewiesene Fähigkeit, geringe Häufigkeit Proteine ​​über TCA ¹⁹ auszufällen. Proteinfällung vor Trypsinverdau wird empfohlen, da wird nicht nur dazu beitragen, Protein (die Trypsin Verdauung hilft) denaturieren, aber beseitigt viele der in der Zelle vorhandenen MS-inkompatible Metaboliten.

Der Vergleich von Spermien Phosphopeptide können in einer Anzahl von Wegen durchgeführt werden. Auf der Grundebene, einen einfachen Vergleich des identifizierten Phosphopeptid in einer Probe, der in einem anderenProbe in dem Verfahren als "spektrale Zählung" bekannt sind, können durchgeführt werden. Aber Kritik an diesem Ansatz im Grunde, weil frühe Proteom-Studien wurden mit niedrigen Wiederholungen gewesen (für eine ausführlichere Diskussion siehe Lundren et al. ^30). Eine anspruchsvollere Ansatz ist es, an der Intensität des Peptids Ausgangsmasse schauen und vergleichen Sie dies mit den anderen Proben (markierungsfreie Vergleich). In dem in 4 gezeigten Beispiel kann ein Peptid abwesend vom vom unbeweglichen (Figur 4 oben), sondern in der beweglichen vorhanden (Abbildung 4 unten) Spermatozoen von m / z 650-670 ersichtlich. Dieser Prozess, der als MS-Label kostenlose Quantifizierung bezeichnet eine markierungsfreie Strategie.

Eine alternative Strategie häufig verwendet, um den Betrag der Durchläufe für die Proteom-Quantifizierung zu reduzieren ist, um Isotope verwenden. Da die Masse eines Isotops anders ist, kann das Massenspektrometer verwendet, um die Intensitäten des Elut vergleichening Peptiden. Jedoch anders als die meisten anderen Zelltypen, einige Isotopenmarkierung kann nicht an Spermien aufgebracht werden. Zum Beispiel kann die Zugabe von stabilen Isotopen (eines schwereren Isotops wird zu einer Probe zugesetzt, während eine leichtere Version wird zu einer anderen zugegeben) in Gewebekultur verwendet werden. Wenn die Isotope bekommen in das Protein eingebaut, kann eine Proteomanalyse durch die Kombination der beiden Proben (Multiplexing) durchgeführt werden. Jedoch in dem Fall von Spermatozoen, kann dies nicht erfolgen, einfach aufgrund der Tatsache, daß 1) eine Isotopenmarkierung erfordert mehrere Durchgänge (bis zu 8) in der Gewebekultur und 2) die Spermien hat keine Kern-Gens die Transkription und Translation und somit sie nicht die Isotope in alle ihre Protein integrieren können trotzdem. Ein Weg, um dieses ist radioaktiv markiertem Mäuse bestellen, diese sind jedoch extrem teuer. Ein alternativer Ansatz besteht darin, eine chemische Markierung verwenden. Dies wurde gemacht, wenn nicht-kapazitierten Mäuse wurden mit kapazitierten Mäusen verglichen. In diesem Fall ist ein D ₀ und ein D _{3 -Marker wurde verwendet, um zwischen einer Probe und einem anderen in dem Massenspektrometer ³¹ zu unterscheiden. Andere Ansätze können die Verwendung von iTRAQ (iTRAQ), wobei Lysinen chemisch unterschiedlicher Masse Isotopen gehören; iCAT (Isotop codierte Affinitäts-Tag), wobei Cysteine ​​mit unterschiedlichen Massen Isotopen und schwere und leichte Wasser Kennzeichnung versehen.}

In jedem einzelnen Fall muss allerdings eine Sache, die im Auge behalten werden. Die MS nur berichtet, was in einer Probe vorhanden ist, und das ist ein Spiegelbild der alles, was in diesem Beispiel bis zu diesem Zeitpunkt geschehen ist. Minimierung der Probenhandhabung bei gleichzeitiger Maximierung der Ausbeute bei jedem Schritt ist für eine erfolgreiche Proteomanalyse notwendig.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,5-Dihydroxy-1,4-benzoquinone	Aldrich	195464
2-D Quantitation Kit	VWR (GE Healthcare)	80-6483-56
Albumin from bovine serum	Sigma	A7030
Ammonia solution 25%	Merck	1.05432
Ammonium bicarbonate	Sigma	A6141
Calcium chloride	Sigma	C5080
CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate	Research Organics	1300C
Chloroform	BDH	10077.6B
Disodium hydrogen phosphate	Merck	1.06580
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9779
Formic acid	Sigma	O6440
Glucose	Sigma	G6152
Glutamine-L	Sigma	G7513
Hepes (free acid)	Sigma	H3375
Iodoacetic acid free acid	Sigma	I4386
Lactic acid	Sigma	L1750
Magnesium chloride	Res. Org.	0090M
Methanol	Merck	10158.6B
Percoll (sterile)	VWR (GE Healthcare)	GEHE17-0891-01
Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt	ThermoFisher Scientific (Pierce)	PIE78420
Potassium chloride	Sigma	P9333
Potassium hydrogen carbonate	Medical Store	CH 600
Sodium bicarbonate	Sigma	S3817
Sodium chloride	Sigma	S7653
Sodium dihydrogen phosphate	Merck	1.06346
Sodium hydrogen carbonate	BDH	10247.4V
Sodium pyruvate	Sigma	S8636
Tris, ultra pure grade	Amresco (Astral)	AM0497
Trypsin Gold, mass spec grade	Promega	V5280
Urea	Sigma	U5128
Zinc chloride	Sigma	Z0173
0.4 mm Polyethylene tubing	Goodfellow	ET317100
30 G needle	Terumo	NN2038R
3 ml Syringe	Terumo	SS035
4.2 mm Polyethylene tubing	Goodfellow	ET317640
Braided silk (5-0)	Dynek	CSS0100
Trichloroacetic acid	Sigma	299537
TiO2 beads (from disassembled column)	Titansphere	6HT68003
Eppendorf Tube	Eppendorf	22431081
C7B30	Sigma	C0856