Die Anwendung der Zwei-Spinnmilbe<em&gt; Tetranychus urticae</em&gt; Für Plant-Schädlingsinteraction Studies

Zusammenfassung

Protokolle für die effiziente Herstellung von homogenen Proben von Spinnmilben, Befall der Versuchspflanzen und Bewertung von Pflanzenschäden, wie für Studien der Pflanzenschädlingseingriff erforderlich entwickelt.

Zusammenfassung

Die beiden Spinnmilbe, Tetranychus urticae, ist ein allgegenwärtiges polyphagen Arthropoden Pflanzenfresser, die auf einem bemerkenswert breites Spektrum von Arten, mit mehr als 150 von wirtschaftlichem Wert-Feeds. Es ist eine große Pest von Gewächshauskulturen, insbesondere in der Nachtschattengewächse und Kürbisgewächse (zB Tomaten, Auberginen, Paprika, Gurken, Zucchini) und Gewächshaus Zierpflanzen (zB Rosen, Chrysanthemen, Nelken), jährliche Feldfrüchte (wie Mais, Baumwolle, Sojabohne und Zuckerrübe) und in Dauerkulturen (Alfalfa, Erdbeeren, Trauben, Zitrusfrüchte und Pflaumen) ^1,2. Neben der extremen polyphagy, dass es ein wichtiger landwirtschaftlicher Schädling, T. macht urticae eine Tendenz hat, Resistenz gegen ein breites Spektrum von Insektizide und Akarizide, die für dessen Steuerung verwendet werden ^3-7 entwickeln.

T. urticae eine ausgezeichnete Versuchsorganismus, da es eine schnelle Lebensdauer (7 Tage bei 27 ° C)und kann leicht in hoher Dichte im Labor gehalten werden. Methoden zur Gen-Expression (einschließlich in-situ-Hybridisierung und Antikörperfärbung) zu untersuchen und um die Expression der Spinnmilbe endogenen Genen mittels RNA-Interferenz zu inaktivieren entwickelt worden ^8-10. Vor kurzem hat die gesamte Genomsequenz von T. urticae wurde berichtet, die Schaffung einer Möglichkeit, diesen Schädling Pflanzenfresser als Modellorganismus mit gleichwertigen genomische Ressourcen, die bereits in einigen seiner Wirtspflanzen (Arabidopsis thaliana und die Tomate Solanum lycopersicum) ¹¹ existieren zu entwickeln. Zusammen könnten diese Modellorganismen Einblicke in die molekularen Grundlagen der Pflanzenschädlings Interaktionen bieten.

Hier eine effiziente Methode zur schnellen und einfachen Sammlung von einer großen Anzahl von erwachsenen weiblichen Milben, deren Anwendung auf einer Versuchsanlage Wirt, und die Bewertung der Anlage Schäden durch Spinnmilbe Fütterung beschrieben. Das vorgestellte Protokoll enmöglicht eine schnelle und effiziente Sammlung von Hunderten von Personen zu jedem beliebigen Entwicklungsstufe (Eier, Larven, Nymphen, erwachsene Männer und Frauen), die für die nachfolgende experimentelle Anwendung verwendet werden kann.

Einleitung

Plant-Schädling Interaktion ist ein Thema von großer wissenschaftlicher und wirtschaftlicher Bedeutung. Es wurde historisch mit beiden Kulturpflanzen (wie Tomate) und der Modellpflanze, A. studierte thaliana. In beiden Fällen ist die Anfälligkeit der Anlagen an den Pflanzenfresser könnten entweder direkt durch die Bewertung von Pflanzen Phänotyp nach Herbivorbefall oder indirekt über die Bewertung der Schädling Leistung gemessen werden.

Direkte Messungen der Suszeptibilität Pflanze zuvor für eine Anzahl von Insektenschädlingsarten unter Verwendung einer Reihe von Verfahren verwendet. Zum Beispiel wird der Fraßschmetterlingslarven als eine Schätzung des Teils von entweder Plutella xylostella (Kohlschabe) oder Trichoplusia ni (Kohlspannerraupe), die durch das bloße Auge mit Hilfe eines Gitters ¹² verbrauchten Pflanzengewebe gemessen. Auch gibt es Verfahren, die digitale Bildgebung von Blattschäden mit anschließender quantitativer Bildanalyse zu verwenden. Solche Verfahren wurden verwendet,Untersuchungen von A. thaliana Interaktion mit Frankliniella occidentalis (westliche Blütenthrips) ^13, Scaptomyza flava (blattminierenden Drosophila) ¹⁴ und T. ni ^15.

Indirekte Messungen von Pflanzenanfälligkeit sind weit verbreitet in den Studien der Pflanzenschädlings Interaktion verwendet. Beispielsweise Empfindlichkeit von A. thaliana zu Blattlaus Myzus persicae Herbivorie Pfirsich wird in der Regel durch die Analyse von Schad Fruchtbarkeit und die Beschreibung des Brutto Morphologie einer Anlage nach der Wechselwirkung ^16,17 bewertet. Ein weiteres typisches indirekter Indikator für A. thaliana Anfälligkeit für einen Schädling ein Trocken-oder Nassgewicht Beurteilung der Pflanzenfresser. Dieser Parameter wird üblicherweise verwendet, um Herbivorie von lepidoterans wie Pieris rapae (kleine weiße), P. charakterisieren xylostella oder T. ni an ihren Larven-oder Puppenstadien ^15,17.

Spinnmilben sind Zellgehalt feEders. Mite-induzierte Schäden als eine Sammlung von chlorotische Flecken, die in der Farbe reichen von weiß bis hellgrün anerkannt. Die Suszeptibilität einer Wirtspflanze zu Spinnmilbenfraß wurde zuvor entweder indirekt durch die Analyse der Spinnmilbe Leistung Tagen bewertet Post-Befall ^18,19 oder direkt mit grobe Morphologie der Pflanzen Wochen nach Befall ¹⁸ oder mit einem digitalen Bild der Blätter ausgesetzt für Tage mit anschließendem automatisierten Bildanalyse ¹⁹ Milben. Diese Verfahren wurden entwickelt und für die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Tomatenpflanzen und T verwendet urticae, und in der Regel verwendet, eine kleine Anzahl von Spinnmilben (5-15 pro Behandlung), die aus der Mischmilbenpopulation erhoben wurden und mit einer weichen Bürste auf der Blattoberfläche platziert. Jedoch sind diese Verfahren nicht geeignet für Untersuchungen, bei denen eine größere Anzahl von Milben angewendet werden müssen. Darüber hinaus, während die direkte Verarbeitung von Blatt Bilder in der Bildanalyse-Softwarewie Adobe Photoshop (San Jose, CA) oder ImageJ ²⁰ kann für die Analyse von Tomaten Schäden verwendet werden, müssen diese Protokolle Modifikation, um auf Blättern, die Reflektivität der Oberfläche mehr haben oder leicht gefärbt und haben gut sichtbare Trichome (angewendet werden zB A. thaliana), die mit automatisierten Auswahl von chlorotische Flecken, die Pflanzenschäden markieren stören. Ferner ist die Entwicklungsstufe des Spinnmilben, die leicht mit den früheren Verfahren verwendet werden können, um die am weitesten verbreitete und leicht identifizierbar erwachsenen Frauen beschränkt und schließt Verwendung anderer Entwicklungsstadien.

Der erste wichtige Schritt in Richtung Hochdurchsatz-Analyse von Pflanzen-Spinnmilbe Interaktion ist es, reproduzierbare, einfache und robuste Protokolle bauen, um Pflanzen mit Spinnmilben herausfordern und zuverlässig beurteilen Interaktion Ergebnisse.

In diesem Video eine effiziente Methode zur schnellen und einfachen Sammlung von einer großen number der erwachsenen weiblichen Milben, deren Anwendung auf einer Versuchsanlage Wirt, und die Bewertung der Anlage Schäden durch Spinnmilbe Fütterung beschrieben. Das vorgestellte Protokoll ermöglicht die schnelle und effiziente Sammlung von Hunderten von Personen zu jedem beliebigen Entwicklungsstufe (Eier, Larven, Nymphen, erwachsene Männer und Frauen), die für die nachfolgende experimentelle Anwendung verwendet werden kann. Darüber hinaus können diese Protokolle einem Milbenwirtspflanze verwendet werden, sind aber insbesondere im Fall von A. nachgewiesen thaliana.

Protokoll

1. Wartung der Spinnenmilbenpopulation

HINWEIS: Spinnmilben auf Kalifornien rote Bohnen aufgezogen (Phaseolus vulgaris).

1. Wachsen Bohnenpflanzen aus Samen für 2-3 Wochen vor Befall.
2. Intermix diese Pflanzen mit befallenen Pflanzen; erwachsenen Milben schnell besiedeln frischen Pflanzenmaterial.
3. Entfernen Sie alte Bohnenpflanzen befallen alle 7-10 Tage, sie mit frischen Pflanzen zu ersetzen.

2. Sammeln Adult Female Milben

1. Mite-Sammlung mit dem Waschverfahren
   1. Um Milben sammeln, legen Sie eine frische Bohnenpflanze in Kontakt mit befallenen Pflanzen 1 bis 2 Tage vor dem Experiment.
   2. Verwenden Sie 20 bis 30 frische Bohnenpflanzen auf 1.000 bis 2.000 erwachsenen weiblichen Milben sammeln.
   3. Eine Lösung von Tween 20 in 0,001% mit Leitungswasser bei Raumtemperatur.
   4. In der Tween 20-Lösung zu waschen befallene Bohnenpflanzen mit 2 bis 3 Pflanzen zu einem Zeitpunkt.
   5. Jede Pflanze wird gewaschen, 2-3x, alle Milben aus den Blättern zu sammeln.
   6. Führen Sie Schritt 2.1.4 innerhalb von 10 min auf Milben vermeiden.
2. Isolierung von Adult Female Milben durch Filtration der Suspension durch Siebe Mite einer bestimmten Maschenöffnung
   1. Bereiten Sieben der folgenden Maschenweiten: 500 um (um Ablagerungen zu entfernen) und 300 um (zu weiblichen erwachsenen Milben sammeln) (Abbildung 1A).
   2. Filtern der Suspension durch das Sieb mit 500 &mgr; m.
   3. ReFilter die Suspension durch die 300 um Sieb. Erwachsene weibliche Milben bleiben erhalten.
   4. Tauchen Sie ein 300 um Sieb mit erwachsenen weiblichen Milben in sauberem Leitungswasser, um das Tween 20 zu entfernen.
   5. Verbreiten Milben in einer einzigen Schicht an der Unterseite des Siebes.
   6. Verwenden Sie Papiertuch, um überschüssige Wasser aus dem Netz und die Seiten des Sieb entfernen. HINWEIS: Dies geschieht, weil Milben, um sich zu erholen schnell trocknen müssen.
   7. Vorbereiten einer Anordnung wie in Fig. 1 gezeigt,B; dies ermöglicht es Milben sich frei zu bewegen, sondern sie an der Flucht zu verhindern.
   8. Platzieren der Sieb mit Milben auf dem Sieb, das als Träger verwendet wird.
   9. Surround unteren Sieb mit Wasser, um Milben Dispergieren verhindern. HINWEIS: Milben startet erholt sich nach ca. 5 min. Nach ca. 30 min, ist die Anzahl der beweglichen Milben ausreichend, um Sammlung (1D) starten. Milben sollte innerhalb von 1 Stunde gesammelt werden, da sie Seide, die mit der Sammlung stören produzieren wird.

3. Anlage Befall mit Milben

HINWEIS: Sobald erwachsene weibliche Milben erholt haben, können sie für die Pflanzenbefall eingesetzt werden. Es gibt 2 Methoden verwendet, um Versuchspflanzen mit Milben befallen erwachsenen Frauen: a) mit einem feinen Pinsel (Protokoll Abschnitt 3.1) und b) mit Hilfe einer Pumpe oder Druckleitung (Protokoll Abschnitt 3.2).

1. Milbenbefall mit einem Pinsel
   HINWEIS: Spinnenmilbenbefallmit einer Bürste zum Auftragen von bis zu 30 Milben pro Pflanze verwendet.
   1. Verwenden Sie ein weiches Haar um Kunstbürste von Größe 00 oder feiner.
   2. Feuchten Sie die Bürste mit RT Leitungswasser.
   3. Sanft abholen Milben aus dem Sieb mit der Pinselspitze und sie auf die Anlage.
2. Milbenbefall mit Hilfe einer Pumpe
   HINWEIS: Anlagen Befall mit Milben durch eine Pumpe / Unterdruckleitung gesammelt wird verwendet, wenn mehr als 30 Milben angewendet werden. Für dieses Verfahren kann eine Vakuumpumpe für mikroelektronische Bauteile Aufnehmer oder eine Vakuumleitung verwendet werden. Es ist wichtig, den Luftstrom konstant ist und eine ausreichende Stärke (2-4 psi) zu halten.
   1. Befestigen einer 1 ml-Pipettenspitze an der Röhre, die der Pumpe oder Druckleitung verbindet unter Verwendung eines 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen Schnitt unten als Adapter zwischen der Pumpe / des Vakuumrohrs und der Spitze.
   2. Legen Sie ein Stück Papiertuch zwischen der Pipettenspitze und dem Adapter (1,5 ml Zentrifugenröhrchen). HINWEIS: Der Zweck ist, zu stoppen Milben innerhalb ter Pipettenspitze während der Aspiration Prozess und auch den Luftstrom (1C) zu reduzieren.
   3. Sammeln Milben direkt aus dem Sieb mit der Pipettenspitze.
   4. Alternativ sammeln Milben nacheinander von befallenen Blätter mit einem Stereoskop.
   5. Wenn die erforderliche Anzahl von Milben gesammelt worden ist, entfernen Sie die Pipettenspitze aus der Röhre, um sicherzustellen, dass das Stück Küchenpapier auf der Rückseite der Pipettenspitze ist ungestört.
   6. Sammeln Milben durch Antippen der Pipettenspitze und verklumpen die Milben zusammen. Dann legen Sie sie auf dem Blatt; innerhalb von Sekunden werden die Milben beginnen, auf dem Blatt zu verteilen.

4. Aufnahme und Bewertung der Pflanzenschäden

1. Recording Pflanzenschäden
   HINWEIS: A. thaliana wird Pflanzenschäden nach 4 Tagen von Milben Fütterung beurteilt. Der Schaden wird als die Gesamtoberfläche der chlorotische Flecken aufgezeichnet. Für Schäden, die Messung wird die ganze Rosette geschnitten und gescannt.Beschriebenen Scan-Parameter sind für einen Epson V30 Scanner, aber wird als ein guter Ausgangspunkt für jede ähnliche Flachbettscanner zu handeln. Halten Sie Scan-Parameter konstant für alle Experimente wodurch ein Vergleich zwischen einzelnen Experiment läuft.
   1. Decken Sie Scanner-Bett mit Transparenz Blatt verunreinigen Scanner Oberfläche mit Pflanzenmaterial zu verhindern.
   2. Schneiden Sie eine ganze Rosette und auf das Scanner-Bett so adaxial (oberen) Seite der Blätter sind mit Blick auf den Scanner Lichtquelle und Fangelement. Alternativ, wenn Rosetten sind zu dicht, um einzelne Blätter zu erfassen, ohne Überlappung, sezieren die Rosette in einzelne Blätter oder Gruppen von nicht-überlappenden Blätter mit feinen Schere, bevor Sie auf dem Scanner-Bett. Mehrere Rosetten können gleichzeitig gescannt werden.
   3. Decken-Rosetten oder Blätter mit einem weißen Blatt Papier, um die Einhaltung und Verunreinigungen der Scannerabdeckung zu verhindern.
   4. Schließen Scannerabdeckung und führen Sie einen Scan mit den folgenden Parametern: Auflösung: 1,200 dpi; Farbmodus: Adobe RGB; Helligkeit: 25; Dateityp: JPEG maximale Qualität.
   5. Speichern von Bilddateien für die spätere Schadensanalyse.
2. Pflanzenschaden Quantifizierung
   HINWEIS: Der Bereich der Schaden wird manuell mit Photoshop berechnet. Aufgrund der großen Unterschiede in Blattform und die Intensität der Farbe der Symptome als Folge der Milbe Fütterung wurden automatische Verfahren unzuverlässig. So wird ein Gitterverfahren verwendet werden, um Pflanzenschäden zu beurteilen:
   1. Öffnen Sie das Bild der Pflanze mit Photoshop.
   2. Erstellen Sie eine neue Ebene, dann gescannte Bild überlagern mit einem Raster von 0,25 mm x 0,25 mm Divisionen (Anzeigen oder Display - Show - Grid, Tastenkombination Strg + ').
   3. Auf einer überlagerten Schicht, markieren beschädigt Blattflächen mit einem Punkt (verwenden Sie den "Stift-Werkzeug", Tastenkombination B). Verwenden Sie einen einzelnen Punkt für jedes Quadrat des Gitters, unter dem es Schäden, die mehr als die Hälfte der Rastereinheit. Die Größe des Punktes wird in Pixel definiert (dh 52 Pixel pro Punkt).
   4. Wenn alle Plätze des Gitters, die Pflanzenschäden, die mindestens die Hälfte der Rastereinheit zeigen, sind mit einem Punkt markiert, verwenden Sie die Histogramm-Werkzeug (Window - Histogramm), um die Gesamtzahl der Pixel auf der Schicht zu bestimmen. Das Histogramm Werkzeug erlaubt es, die Anzahl der Pixel zu messen. Da jeder Punkt durch eine konstante und bekannte Anzahl von Pixeln dargestellt wird, wird das Histogramm Werkzeug die Gesamtzahl der Pixel zu messen, der die Gesamtanzahl von Punkten, und, durch Erweiterung, die Gesamtzahl der Quadrate markiert.
   5. Berechnung der Anzahl der "Punkte" mit der Formel gekennzeichnet:
      Anzahl von Punkten = Gesamtzahl der Pixel / Anzahl der Pixel pro Bildpunkt.
   6. Berechnung der Gesamtfläche der Schaden durch Multiplizieren der Anzahl der markierten Punkte auf dem Bild, das durch den Bereich von 1 Quadratmeter des Netzes, wie ein Punkt entspricht einem Quadrat des Gitters.

Ergebnisse

Mit 20 bis 30 befallene Bohnenpflanzen, kann man rund 2.000 erwachsenen weiblichen Milben sammeln mit Hilfe von Sieben. Die für die 10 Anlagen mit 20 Milben pro Pflanze befallen Zeit beträgt etwa 15 Minuten, wenn mit einem Pinsel, um Milben zu übertragen. Kombinationen von Sammel-und Verarbeitungsmethoden sind in Figur 2 gezeigt.

Dieses Protokoll erzeugt reproduzierbare Ergebnisse von Pflanzenschäden, die zeigen, dass gesammelte Milben sind mit ähnlichen physiologischen...

Diskussion

Dieses Video zeigt Protokolle zur Isolierung und zu Pflanzen mit einer großen Anzahl von erwachsenen weiblichen Milben befallen. Obwohl wir präsentiert dieses Protokoll mit A. thaliana, kann es für jede Anlage-Spinnmilbe Interaktionssystem verwendet werden und wird derzeit erfolgreich auch auf Tomaten-und Wein (Vitis vinifera) Pflanzen aufgebracht. Die Protokoll liefert reproduzierbare Ergebnisse, was anzeigt, dass gesammelte Milben vergleichbarer physiologischen Zustand (Fig. 3). <...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plant material:
California red kidney bean	Stokes, Thorold, ON, Canada		2 week old, well infested with spider mites 2 or 3 days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used.
Chemicals:
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	1% stock solution is prepared to simplify aliquoting
Tap water			At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and performance
Other materials and equipment:
Plastic tray
Set of scissors
2 L beakers
Paper towels
Sets of sieves	Manufactured in house		Detailed instructions are available
Thin brush
Pipettes
Pipette tips			0.2 and 1 ml
1.5 ml centrifuge tubes
Air pump			Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi
Stereoscope
Scanner	Epson	V30	Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments.
Computer			Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software.
Adobe Photoshop software	Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA	various	Any version with Histogram tool included.