Experimentelle Ansätze zur Untersuchung Mitochondriale Lokalisation und Funktion eines Kernzellzyklus-Kinase, Cdk1

Zusammenfassung

Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.

Zusammenfassung

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.

Einleitung

Bei Säugetieren ist die Zellzyklusprogression in Abhängigkeit von hoch geordneten Ereignisse gesteuert von Cyclinen und Cyclin-abhängigen Kinasen (Cdks) ^1. Durch seine zytoplasmatische, nukleare und zentrosomalen Lokalisierung, ist CyclinB1 / Cdk1 ² verschiedene Ereignisse in der Mitose wie Kernhülle Zusammenbruch und Zentrosom Trennung zu synchronisieren können. CyclinB1 / Cdk1 schützt mitotischen Zellen vor Apoptose ³ und fördert mitochondrialen Spaltung, ein entscheidender Schritt für eine gleichmäßige Verteilung der Mitochondrien an die neu ⁴ gebildeten Tochterzellen.

In proliferierenden Säugetierzellen wird die mitochondriale ATP durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) Maschinen (Elektronentransportkette) erzeugt, die von 5 Multi-Untereinheiten-Komplexen zusammengesetzt ist; Komplex I - Komplex V (CI-CV). Nicotinamidadenindinucleotid (NADH): Ubichinon Oxidoreduktase oder Komplex I (CI) ist die größte und am wenigsten verstandenen der fünf Komplexe ^5. Der Komplex consists von 45 Untereinheiten, von denen 14 bilden den katalytischen Kern. Einmal montiert, nimmt der Komplex eine L-förmige Struktur mit einem Arm in die Matrix hervorstehenden und der andere Arm in der inneren Membran ^6,7 eingebettet. Mutationen in CI - Untereinheiten sind die Ursache für eine Vielzahl von mitochondrialen Erkrankungen ^8. Eine funktionell effiziente CI in OXPHOS nicht nur ⁹ zur Gesamt mitochondriale Atmung erforderlich ist , sondern auch für die erfolgreiche Zellzyklusprogression ^10. das Funktionieren dieser membrangebundenen Enzymkomplex in Gesundheit und Krankheit, die Mechanismen Unravelling zugrunde liegen könnte die Entwicklung neuer Diagnoseverfahren und erweiterte therapeutische Strategien ermöglichen. In einer aktuellen Studie haben wir herausgefunden, dass die CyclinB1 / Cdk1 Komplex in die Mitochondrien transloziert in den (Gap 2) G2 / (Mitose) M-Phase und phosphoryliert CI Untereinheiten mitochondriale Energieproduktion zu erhöhen, möglicherweise erhöhten Energiebedarf der Zellen während des Zell ausgeglichen Zyklus ^11. Hier stellen wir showcase experimentellen Verfahren und Strategien, die mitochondriale Translokation von sonst Kern / Zytoplasma-Kinasen, deren mitochondriale Substrate sowie funktionelle Konsequenzen ihrer mitochondrialen Lokalisation mit CyclinB1 / Cdk1 als Beispiel zu studieren verwendet werden kann.

Die Erkenntnis, dass die CyclinB1 / Cdk1 Komplex in die Mitochondrien transloziert, wenn Sie dazu aufgefordert notwendig, um die Studien der Mitochondrien-spezifische Überexpression und Zuschlags dieses Komplexes. In den Mitochondrien-spezifischen Expression von Proteinen zu erreichen, kann man eine Mitochondrien-Targeting-Sequenz (MTS) in den N-Terminus des Proteins von Interesse hinzuzufügen. Mitochondrien - Targeting - Sequenzen ermöglichen die Sortierung der mitochondrialen Proteine ​​in die Mitochondrien , wo sie normalerweise ¹² befinden. Wir haben eine 87 Basen Mitochondrien-Targeting-Sequenz, abgeleitet aus dem Vorläufer von humanem Cytochrom c Oxidase Untereinheit 8A (COX8) und kloniert es in Green Fluorescent Protein (GFP) -markierte CyclinB1 oder Red Fluorescent verwendetProtein (RFP) -markierte Cdk1 Plasmide in Rahmen enthält. Diese Methode erlaubt uns CyclinB1 und Cdk1 in die Mitochondrien zu zielen, insbesondere die mitochondriale Expression dieser Proteine ​​zu ändern, ohne ihre Kern Pool zu beeinflussen. Durch fluoreszenz diese Proteine ​​Tagging, waren wir in der Lage, ihre Lokalisierung in Echtzeit zu überwachen. In ähnlicher Weise haben wir MTS in ein Plasmid, das RFP-markierte dominant negative Cdk1, eingeführt, die uns speziell auf die mitochondriale Expression und Funktion von Cdk1 abreißen dürfen. Es ist wichtig, zwischen mitochondrialen und Kernfunktionen der Kinasen, die haben zwei Lokalisierungen wie Cdk1 zu unterscheiden. Ingenieur MTS in die N-terminale dieser Dual funktionelle Kinasen bietet eine große Strategie, die einfach eingesetzt und wirksam werden.

Da Cdk1 ein Zellzyklus-Kinase ist, ist es von grundlegender Bedeutung die Zellzyklus-Progression, um zu bestimmen, wenn Cdk1 in Mitochondrien lokalisiert ist. Um dies zu erreichen, haben wir ein neues metho genutztd DNA-Gehalt in Zellen zu überwachen. Traditionelle Methoden umfassen BrdU Verwendung (Bromdesoxyuridin) ein synthetisches Thymidin-Analogon, die während der S-Phase des Zellzyklus in die neu synthetisierte DNA umfasst Thymidin zu substituieren. Dann werden die Zellen, die ihre DNA aktiv replizieren können anti-BrdU Antikörper verwendet werden, detektiert. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist , dass es die Denaturierung von DNA erfordert durch harte Methoden wie Säure oder Wärmebehandlung Zugang für den BrdU - Antikörper zu schaffen, die unter Ergebnisse ^13,14 in Inkohärenz führen kann. Alternativ dazu verwendeten wir einen ähnlichen Ansatz, um die teilungsaktiven Zellen, die mit einem anderen Thymidin-Analogon, EdU zu überwachen. EdU Erkennung erfordert keine harte DNA-Denaturierung als einem milden Reinigungsmittel Behandlung Reagenz den Nachweis ermöglicht in neu synthetisierte DNA, die die EdU zuzugreifen. Die EDU - Methode hat sich als zuverlässiger zu sein, konsequent und mit Potenzial für die Hochdurchsatzanalyse ^15.

Schließlich to die mitochondriale Substrate von Cdk1 bestimmen, verwendeten wir eine Proteomik-Tool namens 2D-DIGE, die eine erweiterte Version des klassischen zweidimensionalen Gelelektrophorese ist. Zweidimensionale Elektrophorese trennt Proteine ​​nach ihrem isoelektrischen Punkt in der ersten Dimension und einem Molekulargewicht in der zweiten. Da posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierung den isoelektrischen Punkt und das Molekulargewicht der Proteine ​​beeinflussen, 2D Gele können die Unterschiede zwischen Phosphorylierung Stati von Proteinen in unterschiedlichen Proben nachzuweisen. Die Größe (Fläche und Intensität) von Proteinspots ändert sich mit der Expression von Proteinen, quantitativen Vergleich zwischen mehreren Proben ermöglicht. Mit dieser Methode konnten wir die phosphorylierten Proteine ​​in Wildtyp im Vergleich zu mutierten Mitochondrien-bezogene Cdk1 exprimierenden Zellen zu unterscheiden. Die spezifischen Proteinspots, die im Wildtyp zeigten, wurden aber in den Mitochondrien-Targeting-Mutante Cdk1 Vorbereitung fehlt, wurden isoliert undüber Massenspektrometrie identifiziert.

In herkömmlichen 2D-Gelen sind Triphenylmethanfarbstoffe verwendet, um die Proteine ​​auf dem Gel sichtbar zu machen. 2D-DIGE verwendet fluoreszierendes Protein Etiketten mit minimaler Auswirkung auf die Protein elektrophoretische Mobilität. Verschiedene Proteinproben mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen, miteinander vermischt und durch die identischen Gelen getrennt markiert werden, so dass die Co-Elektrophorese mehrerer Proben auf einem einzigen Gel ^16. Dies minimiert die Gel-zu-Gel-Varianten, die ein kritisches Problem in Gelbasis Proteomstudien ist.

Protokoll

1. Isolierung von Mitochondrien aus kultivierten Zellen

1. Herstellung von Isolationspuffer für Zellen (IBK) Puffer
   1. Bereiten 0,1 M Tris / MOPS (Tris (hydroxymethyl) aminomethan / 3- (N - Morpholino) propansulfonsäure): Man löst 12,1 g Tris in 800 ml destilliertem Wasser, pH - Wert auf 7,4 MOPS Pulver verwenden, fügen Sie destilliertes Wasser auf ein Gesamt Volumen von 1 l und lagern bei 4 ^° C.
   2. Bereiten 0,1 M EGTA (Ethylenglykol-bis (2-aminoethylether) tetraessigsäure) / Tris: Man löst 38,1 g EGTA in 800 ml destilliertem Wasser, pH-Einstellung auf 7,4 unter Verwendung von Tris-Pulver, mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1 l und lagern bei 4 ^° C.
   3. Bereiten Sie 1 M Sucrose: Man löst 34,23 g Saccharose in 100 ml destilliertem Wasser, machen 20 ml Aliquots, und bei -20 ^o C
   4. Bereiten IB _c Puffer: Herstellung von 100 ml IB _C - Puffer durch Zugabe von 10 ml 0,1 M Tris / MOPS und 1 ml von 0,1 M EGTA / Tris auf 20 ml; 1 M Saccharose. Mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml. PH-Einstellung auf 7,4.
2. Herstellung von Zell Lysis Buffer
   1. Bereiten Sie die Lysepuffer, enthaltend 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA (Ethylen-diamino-tetraessigsäure), 1 mM EGTA, 1% Triton-X-100, 2,5 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM β- Glycerophosphat, 1 mM Natriumorthovanadat. Hinzufügen Proteinaseinhibitoren 1 ug / ml Leupeptin und 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) unmittelbar vor Gebrauch.
3. Isolation of Mitochondria
   1. Ernte 3 x 10 ⁷ Zellen mit eiskaltem 1x PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7,4 und Zentrifugen Zellen bei 600 xg für 10 min bei 4 ^o C. Überstand verwerfen und erneut zu suspendieren , das Pellet in 5 ml eiskaltem IB _c - Puffer.
   2. Homogenisieren der Zellen für etwa 10 Minuten ein Glas / Glasgewebemühle verwendet wird. Übertragen das Homogenisat in ein 15 ml-Röhrchen und zentrifugiert bei 600 xg für 10 min bei 4 ^o C Für funktionelle Mitochondrien, verwenden Sie Glas / Teflon-Kupplung, da sie weniger schädlich für die Mitochondrien als die Glas / Glas-Gewebemühle ist.
   3. Sammeln Sie den Überstand in 1,5 - ml - Röhrchen und zentrifugiert bei 7.000 xg für 10 min bei 4 ^o C. Den Überstand in ein 1,5-ml-Röhrchen und speichern als Cytosolprotein.
   4. Waschen Sie das Pellet (Mitochondrien) zweimal mit 200 ul eiskaltem IB _c Puffer und Zentrifuge bei 7000 × g für 10 min bei 4 ^o C
   5. Überstand verwerfen und erneut zu suspendieren , das Pellet in der Puffer Zelllyse und verwenden Sie es sofort oder lagern bei -80 ^o C für die zukünftige Verwendung. Wenn funktionelle Mitochondrien benötigt werden, erneut zu suspendieren, das Pellet in dem verbleibenden Puffer nach der Überstand verworfen. die mitochondriale Fraktion weitere Verdünnung in der Verlust der Funktion der Mitochondrien führen kann. Speichern auf Eis und verwenden Sie die Vorbereitung in 1-3 Stunden für beste Ergebnisse.
   6. Beschallen das resuspendierte Pellet für dreißig 3-sec platzt in eineEisbad Zentrifuge bei 10.000 × g für 5 Minuten, und speichern Sie den Überstand als mitochondriale Fraktion.

2. Co-Immunfärbung von Cdk1, CyclinB1 und COXIV, eine mitochondriale Protein Einwohner

1. Wachsen 5 x 10 ⁴ Zellen auf Deckgläschen in 24-Well - Platten O / N oder bis zu 70% Konfluenz. Saugen Sie das Medium und die Zellen werden zweimal mit 500 ul eiskaltem 1 x PBS, pH-Wert 7,4.
2. Fix-Zellen mit 500 ul eiskaltem 4% Paraformaldehyd bei RT für 10 min. Saugen Sie das Fixier-Lösung und waschen Sie die Zellen mit 500 ul 1 x PBS 3 mal, jeweils 5 min mit sanftem Schütteln bei RT.
3. Permeabilisierung der Zellen mit 0,2% Triton X-100 in 500 ul PBS für 5 min bei RT. Absaugen die Lösung und waschen Sie die Zellen 3-mal, jeweils 5 min mit 500 ul PBS. Fügen Sie die Blockierungslösung (500 & mgr; l, 1% BSA (Rinderserumalbumin) in PBS, das 1% Tween 20 enthält) für 30 min bei RT.
4. Verdünnen Sie die primären Antikörper 1: 250 (v: v) in 5001; l Lösung blockiert und Inkubation der Zellen mit gewünschten Primär in verschiedenen Spezies gebildeten Antikörpern Kreuz Signalisierung (CyclinB1 (Maus) und COXIV (Kaninchen) oder Cdk1 (Maus) und COXIV (Kaninchen) bei RT zu vermeiden, für 30 - 60 min oder O / N bei 4 ^o C
5. Waschen Sie die Deckgläser mit 500 ul 1 x PBS 3 mal, jeweils 5 min und dann Inkubieren mit sekundärem Antikörper, verdünnt 1: 1000 in 500 & mgr; l Blockierungslösung bei RT für 1 h, gefolgt von 500 & mgr; l Wasch PBS 3 mal, jeweils 5 min.
6. Montieren Sie die Deckgläser mit 20 ul anti-fade Befestigungslösung und versiegeln Sie die Dias mit Nagellack. Bild die Dias ein Fluoreszenzmikroskop sofort oder bei 4 ^° C im Dunkeln halten für 1 - 2 Wochen.

3. Natriumkarbonat Extraktion von Intact Mitochondria

1. Wachsen ca. 20 x 10 ⁷ Zellen, Ernte, waschen Sie einmal mit PBS und zu isolieren , die Mitochondrien , wie in Abschnitt 1. Teilen mitochondrialen beschrieben isoliert in zwei parts vor dem letzten Zentrifugation die Mitochondrien zu pelletieren (vor dem Schritt 1.3.4); sparen die Hälfte als die Gesamt Mitochondrien (Schritt 3.2) verwendet werden, verwenden Sie die andere Hälfte für Natriumcarbonat-Extraktion (folgende Schritte 3,3-3,6) löslichen und membrangebundenen Proteinen zu trennen.
2. Lyse die gesamten Mitochondrien Pellet mit 30 ul Puffer Zell - Lyse und speichern Sie das Lysat bei -80 ^o C bis in Immunoblotting verwendet.
3. Nach Eintragen von 250 ul 0,1 M Na ₂ CO ₃ (Natriumcarbonat), pH 11,0, auf die andere Hälfte des mitochondrialen Pellet und Inkubieren auf Eis für 30 min.
4. Zentrifuge bei 100.000 xg für 20 min. Sammeln Sie den Überstand und gehen 3,5 Schritt. Lysieren das Pellet unter Verwendung von 30 ul Zelllyse-Puffer und beschallen, wie in Schritt 1.3.6. Bei -80 ^o C bis in Immunoblotting verwendet.
5. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 20% frisch hergestellten Trichloressigsäure (TCA) zu dem Überstand die Proteine ​​auszufällen und halten auf Eis für 30 min.
6. Zentri- fugalkrUGE bei 15.000 xg für 10 min. Überstand verwerfen, lösen sich die Pellets in 80 ul Zell - Lyse - Puffer und bei -80 ^o C bis in Immunoblotting verwendet.

4. Trennung von inneren und äußeren Membranen von Mitochondrien (Isolierung von Mitoplasts)

1. Wachsen ca. 20 x 10 ⁷ Zellen, Ernte, waschen Sie einmal mit PBS und zu isolieren , die Mitochondrien , wie in Abschnitt 1. Trennen Sie die mitochondriale Fraktionen in 10 gleiche Teile vor der letzten Zentrifugation beschrieben die Mitochondrien zu pelletieren (vor dem Schritt 1.3.4).
2. Auflösen jedes Pellet in 30 & mgr; l der angezeigten Konzentration von hypotonischen Saccharose-Puffer (1 mM EDTA, 10 mM MOPS / KOH (Kaliumhydroxid), pH 7,2; Saccharosekonzentration im Bereich von 25 bis 200 mM) mit oder ohne 50 & mgr; g / ml Trypsin ( siehe Tabelle 1) und Inkubation 30 min auf Eis.
3. Werden 3 ul 10 mM PMSF zu dem Trypsin (eine Endkonzentration von 1 mM PMSF zu erreichen) Fläschchen mit t zu stoppener Verdauung Trypsin und für 10 Minuten auf Eis inkubiert.
4. Zentrifuge bei 14.000 xg bei 4ºC für 10 min. Den Überstand in ein neues Röhrchen, lysieren das Pellet in 30 ul Zell - Lyse - Puffer, beschallen , wie in Schritt 1.3.6, und bei -80 ^o C

5. Konstruktion von Mitochondrien-bezogene GFP / RFP-markierten CyclinB1 / Cdk1 Vektoren und Bestätigung ihrer mitochondriale Lokalisation

1. Klon, der die Mitochondrien-Targeting-Sequenz (MTS; abgeleitet aus dem Vorläufer von humanem Cytochrom c Oxidase Untereinheit 8A (COX8) zwischen den Nukleotiden 76 bis 161) in Rahmen in den N-Terminus von GFP oder RFP an NheI und BamHI-Stellen von pEGFP-N1 oder pERFP -N1 Vektoren Standard molekulare Klonierungstechniken verwendet wird.
2. BamHI-Restriktionsenzym-Erkennungsstellen (fett) an das 5'der PCR-Primer Wenn PCR-Primer für CyclinB1 und Cdk1 Gene entwerfen, hinzuzufügen.
   Vorwärts Cdk1 BamH15 'CAG T GG ATC C AA TGG AAG ATT ATA CCA AAA T
   Reverse - Cdk1 BamH1 5 'CTG T GG ATC C TG CAT CTT CTT AAT CTG ATT
   Vorwärts CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CAA TGG CGC TCC GAG TCA
   Reverse-CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CTG CAC CTT TGC CAC AGC C
3. Amplify die Cdk1 und CyclinB1 Gene dieser Primer folgende Standardtechniken verwendet werden. Digest der PCR-Produkte mit 1 ul Restriktionsenzym BamHI bei 37 ° C für 2 Stunden. Führen Sie die Verdauungsprodukte auf einem 1% Agarosegel. Mit einer Rasierklinge, schneiden Sie die richtige -Aussparung DNA-Fragmente aus und reinigen die DNA aus dem Gel ein Gel-Extraktions-Kits verwenden.
4. Digest 1 ug MTS-pEGFP-N1 und MTS-pERFP-N1 Plasmide mit 1 ul BamHI Enzym bei 37 ° C für 2 Stunden. 1 ul Calf-IntesDarm-alkalischer Phosphatase (CIP) für 30 min bei 37 ° C. Führen Sie die Verdauungsprodukte auf einem 1% Agarosegel und reinige linearen Plasmiden aus Gel, wie in Schritt 5.3.
5. Einrichten einer Ligationsreaktion durch Zugabe von 1 ul Plasmid , das aus Schritt 5.4 und 5 ul Cdk1 oder CyclinB1 aus Schritt 5,3-3 ul Ligasepuffer, 0,5 ul T4 - Ligase und 20,5 ul dH ₂ O. Inkubieren O / N bei 4 ° C.
6. Transformieren von Escherichia coli DH5 & agr; kompetente Zellen mit 10 & mgr; l Ligationsgemisch nach Standardtechniken und wachsen die Bakterien auf 10 mg / ml Kanamycin enthaltenden LB - Agarplatten , O / N bei 37 ° C Kolonien zu erhalten.
7. Suchen Sie sich eine Kolonie von O / N gewachsenen Platten eine sterile Pipettenspitze, legen Sie die Spitze in einen 5 ml Kanamycin-LB-enthaltenden Röhrchen und inkubieren O / N. Isolieren Sie das Plasmid unter Verwendung von Miniprep-Kits gemäß dem Protokoll des Herstellers, und die Sequenz, die das Plasmid mit Standardtechniken.
8. Transfizieren exponentiell wachsenden MCF10A - Zellen (1,5 x 10 ⁴ Zellen auf 96-Well - Platten) mit einer MTS-Cdk1-RFP oder MTS-CyclinB1-GFP Plasmiden aus Schritt 5.7 durch Herstellen eines Plasmid / Transfektionsreagenz Verhältnis von 1: 2 (w: v, 100 ng : 0,2 & mgr; l) in 100 & mgr; l serum- und antibiotikafreiem Medium.
9. In einem CO ₂ -Inkubator mit Feuchtigkeitskontrolle (5% CO _2, 95% relative Luftfeuchtigkeit) bei 37 ° C für 48 Stunden inkubieren , die Zellen in Plasmid / Reagenzienmischung.
10. Vorbereitung 1 mM Stammlösung von mitochondrialen roten und grünen Fluoreszenzfarbstoffe durch 50 & mgr; g Pulver Lösen in 100 ul DMSO. Von der Stammlösungen 1: 400 in 1x PBS 2,5 uM Arbeitslösungen zu erhalten. Die Stammlösungen können für ein Jahr bei -20 ° C gelagert werden.
11. Mix 2 & mgr; l von 2,5 & mgr; M des roten Farbstoffes mit 98 ul Kulturmedium, das eine 50 nM Endkonzentration herzustellen.
12. Ersetzen Sie die Zellkulturmedium von CyclinB1-GFP MCF10A Zellen Lager (erzeugt in Schritt 5.8) mit dem roten Farbstoff Medium für 2 min enthält. Wiederholen Sie diegleiche Verfahren mit grünem Farbstoff für Cdk1-RFP Lager MCF10A Zellen.
13. Zweimal waschen mit 100 ul 1 x PBS loswerden der überschüssige Färbelösung zu erhalten, fügen Sie 100 ul 1x PBS auf die 96-Well-Platte.
14. Visualisieren der Mitochondrien und CyclinB1-GFP (Anregung von 488 nm und einer Emission bei 494 bis 536 nm) und Cdk1-RFP (Anregung von 560 nm und einer Emission bei 565 bis 620 nm) auf 96-Well-Platten unter Fluoreszenzmikroskop bei 40facher Vergrößerung.

6. Identifizierung von differentiell phosphorylierten Proteine ​​über 2D-DIGE

1. Probenvorbereitung
   1. Isolieren Mitochondrien und lysieren mitochondrialen Fraktionen, wie in Schritt 1.3. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 20% TCA (Trichloressigsäure in Wasser) zu jeder Probe und Vortex für 15 Sekunden. Inkubieren Proben auf Eis für 30 min, wie die Proteine ​​aus der Lösung ausfallen.
   2. Zentrifuge Proben bei 9.300 × g bei 4 ° C für 5 min, Überstand zu entfernen, und werden 60 & mgr; l kaltem Aceton (100%), gefolgt vonZentrifugation bei 9.300 × g bei 4 ° C für 5 min.
   3. Wiederholen Sie das Aceton Waschschritt (Schritt 6.1.2) ein weiteres Mal, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die Proben in 50 ul DIGE Markierungspuffer (7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4% CHAPS, 30 mM Tris, pH-Wert 8,5).
2. Bereiten Sie die Fluoreszenzfarbstoffe
   1. Bereiten Stammlösung: Lösen Farbstoffe (5 nmol) in 5 ml frisches Dimethylformamid (DMF) zu einer Endkonzentration von 1 nmol / & mgr; l. Bewahren Sie die Lager Farbstofflösung bei -20 ^° C bis zur Verwendung für ein paar Monate.
   2. Bereiten Sie Arbeitslösung: Lassen Sie Farbstoffe für 5 min bei RT einzustellen. Verdünne 1 ul Farbstoff mit 4 ul DMF zu einer Endkonzentration von 200 pmol / & mgr; l. Halten Sie sich auf Eis während des Gebrauchs. Anmerkung: Die Arbeitslösung kann für 3 Wochen bei -20 ^o C aufbewahrt.
3. Label - Proteine
   1. Mischen Sie 1 ul Arbeitsfarbstofflösung pro 12,5 ug Protein. Scale up nach Bedarf. Für gepoolt Standards, fügen Sie 61; l von Cy2 Arbeitslösung zu 300 & mgr; g Protein gepoolt.
   2. Vortex für 30 sec und Zentrifuge bei 4 ° C für 30 sec bei 12.000 x g. Inkubieren auf Eis im Dunkeln für 30 min. Stoppen Sie die Markierung durch Zugabe von 1 & mgr; l von 10 mM Lysin pro 1 ul Arbeitslösung verwendet. Gut mischen und Inkubation auf Eis im Dunkeln für 10 min.
   3. Pool individuell markierten Proben und mischen sich mit Rehydrationspuffer (7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4% CHAPS, 1,2% destreak, 1% pharmalytes, Bromphenolblau). Das Gesamtvolumen wird 125 ul sein.
   4. Vortex Proben für 30 Sekunden und lassen Sie Proben für 30 min bei RT einzustellen. Last 125 & mgr; l Proben auf 7 cm pH 4-9, isoelektrische Fokussierung (IEF) Streifen.
4. Erste Dimension Elektrophorese
   1. Legen Sie die Streifenhalter (Särge) auf der Elektrodenplatte, sicherstellen, dass die Streifenhalter sind absolut sauber und trocken. Pipette 125 ul-Proben in einen Sarg, gleichmäßig über die gesamte Sarg zu verbreiten.
   2. Mit tweezers, nehmen Sie den IEF Streifen auf, sorgfältig die Kunststoff-Schutzabdeckung zu entfernen, und es (Gel-Seite nach unten) in Sarg / Rehydrationspuffer platzieren. Vermeiden Sie Luftblasen einzufangen. Füllen Sie langsam Sarg (1 - 1,5 ml) mit Mineralöl und setzen den Sarg auf die Särge bedeckt.
   3. Beginnen isoelektrischen nach dem Protokoll in der Tabelle mit Schwerpunkt 2:
      Hinweis: Wenn der Lauf beendet ist, können die Streifen in Plastikröhrchen bei -80 ^o C aufbewahrt werden oder verschoben direkt auf Equilibrierung und der zweiten Dimension.
5. Zweite Dimension - Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid - Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
   1. Equilibrierung
      1. Auftauen SDS Äquilibrierungspuffer (8 ml pro Streifen, 6 M Harnstoff, 30% Glycerin, 2% SDS). Abwiegen Dithiothreitol (DTT; 10 mg DTT pro 1 ml SDS Äquilibrierungspuffer). Man löst DTT in 4 ml SDS Äquilibrierungspuffer.
      2. Abwiegen IAA (Iodacetamid, 25 mg IAA pro 1 ml SDS Äquilibrierungspuffer).Löse IAA in 4 ml SDS Äquilibrierungspuffer.
      3. Schmelze 1 ml Dichtungs Agarose-Lösung in einem Wasserbad für eine spätere Verwendung.
      4. Wenn die Streifen eingefroren wurden, damit sie vollständig auftauen. Legen Sie die Streifen Gel Seite nach oben in die reswelling Fach. 4 ml SDS Äquilibrierungspuffer mit DVB-T zu jedem Streifen und Inkubation für 15 min unter leichtem Schütteln.
      5. Gießen Sie alle SDS Äquilibrierungspuffer mit DTT ab. 4 ml SDS Äquilibrierungspuffer mit IAA zu jedem Streifen und Inkubation für weitere 15 Minuten unter leichtem Schütteln. Nach Äquilibrierung mit dem IAA-Puffer, gießen des Äquilibrierungspuffer SDS.
   2. SDS-PAGE
      1. Packen Sie Minigel, nehmen Sie den Kamm und spülen Sie das Gel und die Vertiefungen mit ddH ₂ O. Entfernen Sie das weiße Band am unteren Rand des Gels vor der Ausführung. Richten Sie den Streifen auf dem Gel richtig, Gel Orientierung ist für Punktschneiden kritisch.
      2. Legen Sie das Gel flach auf Zähler mit der kleinen Platte und Gel Oberseite nach experimenter. Legen Sie den Streifen auf die hohen Platte mit anodische Ende (++ enden mit dem Barcode) auf der linken Seite des Gels gegenüber. Mit einem Lineal, langsam schieben Sie den Streifen nach unten auf Geloberfläche. Vermeiden Sie Luftblasen zwischen dem Streifen Einfangen und das Gel. Stellen Sie das Gel nach oben in einer Glasplatte stehen.
      3. 1 ml der Heißsiegel Agarose-Lösung auf die Öffnung der Kassette. Stellen Sie sicher, dass alle Luftblasen einen flachen Lineal herausgedrückt werden. Montieren Sie das Gerät und führen Sie das Gel mit einer konstanten 125 V für 90 min.
      4. Wenn das Gel Ausführung beendet ist , legen Sie das Gel auf einer biomolekularen Imager mit 2 ml ddH ₂ O und scannen Sie das Gel in der Fluoreszenzerfassungsmodus mit 635 nm Anregungslaser und 665 nm Emissionsfilter.
   3. Phosphoprotein Anfärben
      1. Befestigen Sie das Gel mit 50% Methanol und 10% Essigsäure-Mischung (10 ml) für 30 Minuten zweimal. Waschen mit 10 ml Wasser für 10 min und dreimal mit 10 ml stain stain Phosphoprotein für 60-90 min, gefolgt vonEntfärben mit 10 ml destain Lösung für 30 min dreimal.
      2. Waschen mit 10 ml Wasser 5 min zweimal und Bild das Gel mit einem Laser-Gelscanner bei 532 nm / 560 nm Anregung / Emission.
   4. Proteinverdauung und Identifizierung
      1. Excise alle der differentiell exprimierten Proteinspots aus dem Gel in Mikrotitervertiefungen mit Hilfe eines Roboter-Spot-Picker nach Herstellerangaben, und mit 100 mM Ammoniumbicarbonat (2 ml) für 1 Stunde bei RT die Gelstücke entfärben. Entwässern mit 2 ml 100% Acetonitril zweimal waschen und trocken in einem Vakuum-Konzentrator für 30 min.
      2. Rehydratisieren die Gelstücke mit 100 ul von 13 ng / & mgr; l modifiziertes porcine Trypsin in 50 mM Ammoniumbicarbonat für 16 Stunden bei 37 ° C. Sammeln der Überstände und Extrahieren weiterhin die Proteine ​​mit 100 & mgr; l von 5% Trifluoressigsäure in 50% Acetonitril für 30 min.
      3. Konzentrieren Sie die Peptide auf 5 & mgr; l von Vakuumzentrifuge concentrator und analysieren mit MALDI - Ionisation - Time of Flight - Tandem - Massenspektrometrie - Analyse (MALDI - TOF-MS / MS) ^17.

7. In - vitro - Kinase - Assay

1. Herstellung von Substraten
   1. Sub-Klon Complex I (CI) Untereinheiten (NDUFV1, NDUFV3, NDUFS2, NDUFB6 und NDUFA12), die als unterschiedlich phosphorylierten Cdk1 Ziele identifiziert werden, in pGEX-5X-1-Vektor zu erzeugen, Glutathione-S-Transferase (GST) -markierte bakteriellen Expressionsplasmide ^11. Reinige CI-Untereinheiten, die eine hohe Affinität Glutathion Spalten nach unten Protokoll.
      1. Kultur GST-tagged CI - Untereinheit enthaltende Escherichia coli - Stamm BL-21 in Luria-Bertani (LB) Medium mit 50 ug / ml Ampicillin in einem Schüttler bei 37 ^° C bis eine optische Dichte (OD) von 0,6 erreicht wurde. Fügen Sie Isopropyl-bD-Thio-galactopyranosid (IPTG) zum Kulture in einer Endkonzentration von 0,1 mM, und für weitere 3 h inkubiert.
      2. Zentrifuge bei 600 × g für 10 min, um die Bakterien zu sammeln und zu resuspendieren in 5 ml 1 x PBS Puffer, der 5 mM DTT, 1 x Proteinase-Inhibitor-Cocktail, und 0,1% Lysozym. Lyse der Zellen durch Beschallung für zwanzig 5 s-Bursts und bei 600 xg für 10 min, um die Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt werden.
      3. Sammeln Sie den Überstand und Inkubation mit Glutathion-Agarose-4B-Kügelchen in einem Volumenverhältnis von 4: 1 (Überstand: bead) für 1 h bei RT.
      4. Eluieren die GST-Fusionsproteine ​​aus den Perlen mit 3 ml Glutathion-Elutionspuffer (10 mM reduziertem Glutathion in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) und unter 12 die eluierten Proteine ​​Dialyse in molekularen poröse Membran Schlauch (Molekulargewicht cut-off -14 Kilo-Dalton), mit 1 x PBS / 1 mM EDTA. Lagern Sie die gereinigte Proteine ​​bei - 80 ^o C.
2. Cdk1 Kinase - Assay
   1. Vor der Kinase ass zu startenay, stellen Heizblöcke bis 30 ° C und 100 ° C. Thaw kommerziellen CyclinB1 / Cdk1 Enzymkomplex und Substrate auf dem Eis.
   2. Bereiten Sie die Reaktionsmischung auf Eis. Seit ³² P ATP - Isotop beteiligt ist, bereiten alle Reaktionsmischungen in 1,5 ml Probenröhrchen mit Schraubverschluss einen O - Ring enthält Ausbreitung von Radioaktivität zu verhindern.
      Achtung: Folgen Sie den radioaktiven Stoffen Schutzvorschriften. Verwenden Sie eine 8 mm dicke Plexiglas Abschirmung und Arbeit zumindest auf eine Armlänge. Wischen Sie alle kontaminierten Bereich mit Wasser.
   3. Vorbereiten eines 30 & mgr; l Reaktionspuffer , enthaltend 1 x Cdk1 - Puffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2, 2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0,01% Brij 35, pH 7,5), 0,6 mM kaltes ATP, 0,1 & mgr; Ci ³² P ATP, 2 Einheiten CyclinB1 / Cdk1 und 6 ug Substrat-Protein. Stellen Sie die Lautstärke auf 30 & mgr; l mit ddH ₂ O. Für positive Kontrollreaktion, ersetzen Sie das Substrat mit 0,01 mM Histon H1, einem bekannten CyclinB1 / Cdk1 Substrat.
      1. Für negative control Reaktionen (1) ersetzen, das Substrat mit GST-Protein nur und (2) ersetzen, das Substrat mit 0,01 mM Histon H1 + 0,5 uM RO-3306, einem selektiven Cdk1-Inhibitor.
   4. Gut mischen mit Pipette und Zentrifuge bringen die gesamte Flüssigkeit auf dem Boden des Röhrchens, minimiert Risiko der Kontamination. für 60 min bei 30 ° C inkubieren.
   5. Liste 6 ul 5x SDS - Probenpuffer , die Reaktion zu stoppen und zu denaturieren , bei 100 ^o C für 10 min. Führen Sie Proben auf 10% SDS-PAGE-Gel bei 160 V für 2 Stunden oder bis Farbstofffront das Ende des Gels erreicht. Übertragen Sie Gel auf eine Chromatographie-Papier und wickeln mit Plastikfolie.
      Achtung: Alle Flüssigkeit in Kontakt mit Radioisotopen sollte als radioaktiver Abfall und entsorgt gemäß Richtlinien des Instituts durch die Umwelt, Gesundheit und Sicherheit Dienstleistungen in einem Poly carboy 5-Gallonen behandelt werden.
   6. Setzen Sie das Gel auf einem Röntgenfilm für 1 Tag oder bis zu 1 Woche bei -20 ^° C auf die spezifische Aktivität des Radioisotops je nach verwendetemund das Enzym.

8. gerichtete Mutagenese zu generieren Dominant Negative Cdk1 (D146N)

1. Design-Mutagenese-Primer; zwei Primern, komplementär zueinander sind, das mutierte Stelle enthält (G wird durch eine Nukleotidsequenz ersetzt werden für N anstelle von D Aminosäure zu codieren) von 20 Basen auf jeder Seite ¹¹ flankiert.
2. Vorbereiten eines 50 & mgr; l Polymerase - Kettenreaktion (PCR) Gemisches 1x Reaktionspuffer, 2,5 mM dNTPs, 10 & mgr; M Primer (vorwärts und rückwärts), 40 ng des Templats enthält, und ddH ₂ O. Hinzufügen, 2,5 U der DNA-Polymerase in die Reaktions.
3. Den folgenden PCR-Programm: 95 ° C 3 min, 95 ° C 30 sec, 55 ° C 30 min, 68 ° C 6 min; 16 Zyklen (Anmerkung: 68 ° C Inkubationszeit wird durch die Größe der DNA bestimmt 1 min / kb für DNA ≤ 10 kb erforderlich Für größere DNA, 2 min / kb plus 10 Sekunden pro Zyklus..). Folgen Sie von 68 ° C 7 min und halten bei 4 ° C bis zur Verwendung.
4. Hinzufügen2 ul Dpn I - Restriktionsenzym (10 U / ul) und 5,7 ul Dpn I - Puffer, gut mischen mit leichtes Antippen mit dem Finger und die Reaktion bei 37 ^° C für 1 Stunde inkubiert.
5. Transfer 10 ul Dpn I-behandelten PCR-Produkte in 50 ul kompetente DH5a-Zellen für die Transformation. Inkubieren auf Eis für 30 min, gefolgt von 45 Sekunden Hitzeschock bei 42 ^° C und 5 min auf Eis. In 500 ul LB und schütteln bei 37 ^° C für 1 Stunde vor dem Ausstreichen auf LB-Agar - Platten. Inkubieren O / N bei 37 ^o C.
6. Wählen Sie eine Kolonie von der O / N Agarplatten eine sterile gelben Pipettenspitze, fallen die Spitze in ein Röhrchen , enthaltend 5 ml LB gezüchtet und wachsen O / N bei 37 ^o C shaker. Isolieren Plasmid, das ein Miniprep Kit und die Plasmid-Sequenz die Mutation zu bestätigen gemäß dem Protokoll des Herstellers.

9. Bestimmung der Zellzyklusphasenlängen mit EdU Inkorporationstest

1. Zellsortierung
   1. Transfect 2 x 10 ⁵ Zellen mit den angegebenen Vektoren (MTS-GFP / RFP, MTS-CyclinB1-GFP / Cdk1-wt-RFP oder MTS-Cdk1-dn-RFP) in einer 6-Well - Platte mit 1: 2 (w: v , 2,5 ug: 5 ul) Verhältnis von DNA: Transfektionsreagenz Mischung in 2,5 ml serum- und antibiotikafreien Kulturmedien für 48 Stunden hergestellt. Live-Art-Zellen, die stabil die GFP-markierten Cdk1 und RFP-markierte CyclinB1 Proteine ​​über Durchflusszytometer.
      1. Wash - Zellen mit 1 x PBS, 100 & mgr; l Trypsin in die Schale und Inkubation bei 37 ^° C für 5 min. 2 ml Kulturmedium, die Zellen zu sammeln und leiten sie durch einen 70 um-Filter eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Waschen Sie die Einzelzellsuspension mit 500 ul 1% fötales Kälberserum in PBS (FCS / PBS), bevor sie auf cytometer Strömung zu laden.
      2. Richten Sie die Sortierparameter etabliert folgende Protokolle ¹⁸ - Gating für doppelt positiven Zellen gefärbt mit beiden GFP und RFP. Sammeln Sie die sortierten Zellen kommen aus dem Zytometer in ein Rohr containing Zellkulturmedium und verwenden diese Zellen für die Analyse der Zellzyklusprogression mit EdU Pulse-Chase-Kennzeichnung wie in Protokoll 9.2.
2. Die Messung der Zellzykluslänge anhand der EdU Labeling Durchflusszytometrie - Assay
   1. Seed sortierten Zellen in 6-Well - Platten bei einer Dichte von 2,5 x 10 ⁵ Zellen pro Vertiefung und der Kultur O / N bei 37 ^° C in einem CO ₂ -Inkubator. Hinzufügen EdU zu dem Kulturmedium in einer Endkonzentration von 25 uM. Für 1 Stunde in einem CO ₂ -Inkubator bei 37 ^° C inkubieren.
   2. Wasche die Zellen mit 1% BSA in 500 ul PBS und sammeln sie in einem 1,5 ml Röhrchen bei 2 Stunden Intervallen für insgesamt 10 bis 12 Stunden.
   3. Centrifuge Zellen bei 350 xg für 5 min den Überstand verwerfen. Vertreiben Sie das Pellet durch Zugabe von 100 & mgr; l der Fixierlösung (vom Hersteller im EdU Labeling Kit) für 15 min bei RT und gut mischen.
   4. Wasche die Zellen mit 1 ml von 1% BSA in PBS dreimal. Fix dieZellen erneut mit 0,5 ml 70% Ethanol O / N bei 4 ^o C
      Hinweis: Ethanol Fixierung kritisch ist die interne GFP / RFP Fluoreszenz aufgrund des rekombinanten-markierten Protein-Expression zu stillen.
   5. Zentrifugiere die Zellen erneut bei 350 xg für 5 min und wasche das Pellet mit 1 ml 1% BSA in PBS einmal. Resuspendieren der Zellen in 1 ml Permeabilisierung Puffer (0,1% Triton-X-100, 1% BSA, 0,2 mg / ml RNase A in PBS) für 20 min bei RT.
   6. Wasche die Zellen mit 1 ml von 1% BSA in PBS einmal. In 0,5 ml Reaktions Cocktail in jedes Röhrchen und gut mischen. Inkubieren Reaktionsgemisch bei RT für 30 min im Dunkeln.
   7. Waschen mit 1 ml 1% BSA in PBS einmal und Flecken DNA mit 50 & mgr; g / ml Propidiumiodid (PI) in 1 ml 1% BSA in PBS.
   8. Analysieren Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie die EDU-positiven Bevölkerung zu folgen. Anwesend Streupunktdiagramm von EDU-markierten Zellen gefärbt für den DNA-Gehalt (PI-Färbung, X-Achse) und EDU (Alexa 647 Färbung, Y-Achse).
      1. Verwenden Sie APC-Kanal für AlexA647-edu ein 670/30 Bandpassfilter mit allem Licht vorhanden Verwendung von weniger als 685 nm, dass die Filter schlagen; und Phycoerythrin (PE) Kanal für PI mit einem 581/15 Bandpassfilter vor ihm mit allem Licht vorhanden weniger als 600 nm, dass die Filter zu schlagen.
      2. Legen Sie die ersten Schlauchzellen in die Durchflusszytometrie und die Verwendung einer Standard-Gating-Strategie für den Erwerb enthält: Plot FSC-Area X SSC-Bereich für Morphologie, gefolgt von PI (PE-Kanal) X Alexa647-edu (APC-Kanal) für Zellfärbung. Nehmen Sie Daten für alle Rohre einzeln zu erwerben 10.000 Ereignissen pro Probe.
      3. Bestimmen Sie den Zellzyklus - Phasenverteilung der Zellen und Phasenlängen eine Durchflusszytometrie Datenanalyse - Software mit folgenden etablierten Protokollen ^11,30.

Ergebnisse

Sub-mitochondriale Lokalisation von CyclinB1 und Cdk1

Natriumcarbonat Extraktion wird verwendet, um zu bestimmen, ob ein Protein in der Mitochondrien oder an der Außenfläche angeordnet ist, nämlich der äußeren Membran. Sobald ein Protein im Inneren der Mitochondrien, weitere Bestimmung der Unter mitochondriale Lokalisation gezeigt wird zu lokalisieren kann über mitoplasting kombiniert mit Proteaseverdau ...

Diskussion

Wie die Proteine ​​für andere subzelluläre Organellen bestimmt, die mitochondriale Zielproteine ​​besitzen Targeting - Signale in ihrer primären oder sekundären Struktur , die sie dem Organell mit Hilfe von aufwendigen Protein translocating und Falzmaschinen ^21,22 lenken. Mitochondrien - Targeting - Sequenzen (MTS) aus ausschließlich mitochondrialen resident Proteine ​​wie COX8 erhalten kann , um N-Terminus von jedem Gen - Sequenz hinzugefügt werden , um spezifische Proteine ​​in die Mit...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
32P ATP	PerkinElmer	BLU002001MC
Anti-mouse secondary antibody	Invitrogen	A-11003	Alexa-546 conjugated
Anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen	A11029	Alexa-488 conjugated
ATP	Research Organics	1166A	For in vitro kinase assay
Cdk1 antibody	Cell Signaling Technology	9112
Cdk1 kinase buffer	New England Biolabs	P6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit	Life Technologies	C10337	For cell cycle analysis with EdU labeling
COX IV antibody	Cell Signaling Technology	4844S	For mitochondrial immunostaining
Cyclin B1 antibody	Santa Cruz Biotech	sc-752
CyclinB1/Cdk1 enzyme complex	New England Biolabs	P6020S	Avoid freeze/thaw
CyDye DIGE Fluor Labeling Kit	GE Healthcare Life Sciences	25-8009-83
DIGE Gel and DIGE Buffer Kit	GE Healthcare Life Sciences	28-9480-26 AA
Dimethylformamide	Sigma Aldrich	319937	DMF
Dithiothreitol	Bio-Rad	161-0611	DTT
dNTP	EMD Millipore	71004	For site-directed mutagenesis
Dpn I enzyme	Stratagene	200519-53	For site-directed mutagenesis
Dry Strip cover fluid	GE Healthcare Life Sciences	17-1335-01	Used as mineral oil
EDTA	J.T. Baker	4040-03
EGTA	Acros Organics	409910250
Eppendorf Vacufuge Concentrator	Fisher Scientific	07-748-13	Used as vacuum centrifuge concentrator
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01	Anti-fade mounting solution
Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences	649908	For cell cycle analysis with EdU labeling
Histone H1	Calbiochem	382150	For in vitro kinase assay
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	For purifying DNA fragments from agarose gels
Immobiline DryStrip Gels	GE Healthcare Life Sciences	18-1016-61	IEF (isoelectric focusing) strips
Immobilized Glutathione	Thermo Scientific	15160	Glutathione-agarose beads
Iodoacetamide	Sigma Aldrich	I1149	IAA
IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit	GE Healthcare Life Sciences	11-0033-64	IPGphor strip holders
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside	RPI Corp	156000-5.0	IPTG
Leupeptin	Sigma Aldrich	L9783	For cell lysis buffer
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668027	Transfection reagent
Lysine	Sigma Aldrich	L5501	For CyDye labeling
Lysozyme	EMD Chemicals	5960
Mitoctracker Red/Green	Invitrogen	M7512/M7514	Mitochondrial fluorescent dyes
MOPS	EMD Chemicals	6310
pEGFP-N1	Clonetech	6085-1	GFP-expressing vector
Pfu	Stratagene	600-255-52
pGEX-5X-1	GE Healthcare Life Sciences	28-9545-53	GST-expressing vector
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Shelton Scientific	IB01090	PMSF
Phosphate buffered saline	Life Technologies	14040	PBS
Spectra/Por 4 dialysis tubing	Spectrum Labs	132700	as porous membrane tubing for dialysis
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain	Life Technologies	P-33300	For staining phosphoproteins on 2D gels
Proteinase inhibitor cocktail	Calbiochem	539134	For cell lysis buffer
QuikChange site-directed mutagenesis kit	Stratagene	200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	MiniPrep Plasmid Isolation Kit
RO-3306	Alexis Biochemicals	270-463-M001	Cdk1 inhibitor
Rotenone	MP Biomedicals	150154	Complex I inhibitor
Sodium carbonate	Fisher Scientific	S93359
Sodium chloride	EMD Chemicals	SX0420-5	For cell lysis buffer
Sodium orthovanadate	MP Biomedicals	159664	For cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate decahydrate	Alfa Aesar	33385	For cell lysis buffer
Sodium β-glycerophosphate	Alfa Aesar	L03425	For cell lysis buffer
SpectraMax M2e	Molecular Devices	M2E	Microplate reader
Sucrose	Fisher Scientific	57-50-1
Tissue Grinder pestle	Kimble Chase	885301-0007	For mitochondria isolation
Tissue Grinder tube	Kimble Chase	885303-0007	For mitochondria isolation
Trichloroacetic acid solution	Sigma Aldrich	T0699	TCA
Tris	MP Biomedicals	103133
Triton-x-100	Teknova	T1105
Trypsin	Calbiochem	650211
Typhoon Imager	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	Laser gel scanner fro 2D-DIGE
Ubiquinone	Sigma Aldrich	C7956