Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Zusammenfassung

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Zusammenfassung

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Einleitung

Derzeit Einzelzellen einzeln in einem Kulturraum platziert wird üblicherweise durch Verwendung limitierende Verdünnung oder fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) erzielt. Für viele Laboratorien limitierende Verdünnung ist ein zweckmßiges Verfahren, da es nur eine Pipette und Gewebekulturplatten benötigt, die leicht verfügbar sind. In diesem Fall wird eine Zellsuspension zu einer geeigneten Zelldichte seriell verdünnt und dann in Kulturvertiefungen gegeben durch eine manuelle Pipette. Diese abgeteilten Einzelzellen werden dann für die Zellanalyse verwendet werden, wie genetische Heterogenität Screenen ¹ und Koloniebildung ^2. Jedoch ist dieses Verfahren mit niedrigem Durchsatz und arbeitsintensiv, ohne einen Roboterarm zur Unterstützung verwendet wird , weil die Poisson - Verteilung der Natur des Verfahrens limitierende Verdünnungseinzelzellereignisse bis zu einer maximalen Wahrscheinlichkeit von 37% ³ einschränkt. FACS-Maschinen mit einem integrierten Roboterarm kann die Begrenzung der Poisson-Verteilung zu überwinden, indem genau placing einer Einzelzelle in einer Kultur auch in einer Zeit ^4. Die hohe mechanische Scherspannung jedoch (so senkte die Lebensfähigkeit der Zellen) ⁵ und Maschinenkauf und Betriebskosten haben seine Verwendung in vielen Labors beschränkt.

Um die oben genannten Einschränkungen zu überwinden, mikroskaligen Geräte wurden entwickelt , um sehr effizient einzelne Zellen in Mikrovertiefungen ⁶ laden. Jedoch bieten die Mikrotitervertiefungen nicht ausreichend Platz für die beladenen Zellen zu proliferieren, aufgrund der Notwendigkeit der Herstellung der Größe jedes der von einer einzigen Zelle schließen Mikrotiterplatten-Einzelzelllade Wahrscheinlichkeit zu maximieren. Als Kulturassays in vielen zellbasierten Anwendungen erforderlich sind (zB Klonogentest ^7), größere Kavitäten (90 bis 650 & mgr; m im Durchmesser oder in Seitenlänge) wurden ebenfalls verwendet worden , für längere Zellkulturen zu ermöglichen. Jedoch, wie das Grenzverdünnungsverfahren, sie besitzen auch eine niedrige einzelne Zelle Ladewirkungsgrade im Bereich von 10 -. 30% ⁸9

Zuvor haben wir ein Hochdurchsatz - mikrofluidischen Plattform zu isolieren Einzelzellen in den einzelnen Kavitäten entwickelt und zeigen ihre Anwendung in klonogenen Assay der isolierten Zellen. Die Vorrichtung ¹⁰ mit poly-dimethylsiloxan (PDMS) hergestellt wurde, und weist zwei Sätze von Mikrovertiefungsarrays mit verschiedenen Mikrovertiefungsgrößen, was die Effizienz in dem Laden einer einzelnen Zelle in einer Mikrovertiefung, deren Größe wesentlich größer als die Zelle weitgehend verbessern. Bemerkenswert ist, ermöglicht diese "dual-well" -Konzept die Größe des Kulturbereich flexibel, ohne dass die Einzelzellen-Abscheidungseffizienz zu beeinflussen eingestellt werden, so dass es einfach, die Konstruktion der Vorrichtung zur Einstellung verschiedener Zelltypen und Anwendungen anzupassen. Diese hocheffiziente Methode sollte für die langfristige Zellkulturexperimente für die Zell Heterogenität Studien und monoklonale Zelllinie Einrichtung nützlich sein.

Protokoll

Hinweis: Die Fotomasken-Designs für unsere Mikrofluidik-Vorrichtung Fertigung wurden gezeichnet von einem Computer Aided Design (CAD) Software. Die Entwürfe wurden dann verwendet, um Chrom Photomasken herzustellen Kommerzielle Dienst. Die PDMS - Geräte wurden unter Verwendung von weichen Lithographietechniken hergestellt. ¹¹

1. Herstellung von Urformen von Lithography

1. Vor dem photolithographischen Prozeß ^12, verwenden , um die 4-Zoll - Siliziumwafer als Substrat und entwässern um die Wafer in einem konventionellen Ofen bei 120 ° C für 10 min.
2. Reinigen Sie die dehydriert Silizium-Wafern durch Sauerstoffplasmabehandlung bei 100 Watt für 30 Sekunden in einem Plasma-Reiniger.
3. Vorwärmen zwei Kochplatten bei 65 ° C und 95 ° C, jeweils für die nachfolgenden Backvorgang.
4. Mantel 5 g negativer Photoresist (PR) auf den gereinigten Siliziumwafer durch eine Schleuderbeschichtungsvorrichtung; Spin bei 1200 Umdrehungen pro Minute (SU-8 50) für 30 Sekunden die Mikrokanalschicht zu erzeugen.
5. Legen Sie die PRbeschichteten Wafers auf eine vorgeheizte Heizplatte bei 65 ° C für 12 min und übertragen sie für 33 min bei 95 ° C auf einen anderen vorgewärmte Heizplatte (100 & mgr; m dicken Muster) einen weichen Bake-Verfahren durchzuführen.
6. Nach dem Backen, legen Sie die PR beschichteten Silizium-Wafer auf dem Halter eines halbautomatischen Mask Aligner und richten Sie sie auf eine 25.400 dpi Auflösung Transparenz Photomaske.
7. Setzen Sie den PR beschichteten Silizium - Wafers mit UV - Licht (365 nm) in einer Dosis von 500 mJ / cm ² , um die PR - Muster auf dem Silizium - Wafer zu schaffen.
8. Entfernen Sie den Wafer von dem Ausrichter und legen Sie es auf einer Heizplatte für die Zeit nach dem Backen bei 95 ° C für 12 min.
9. Weichen Sie die Wafer in SU-8-Entwickler (Propylenglykolmonomethylether Acetat, PGMEA) -Lösung nicht vernetzten PR für 12 min zu waschen und sanft mit Stickstoffgas trocken die Ausrichtungsmarken zu belichten.
10. Wiederum Mantel 5 g negativen Photoresists auf den Wafern durch eine Schleuderbeschichtungsvorrichtung; Spin bei 700 Umdrehungen pro Minute (SU-8 100) für 30 Sekunden und 1200 Umdrehungen pro Minute (SU-8 10) 30 s für 300 &# 181; m dicke Muster und 27 & mgr; m dicken Muster jeweils die Mikrowell-Schicht zu machen.
11. Platzieren Sie den PR beschichtete Wafer auf einer Heizplatte bei 65 ° C für 4 min und bei 95 ° C für 8 min (27 & mgr; m tief capture-well layer); und bei 65 ° C für 40 min und bei 95 ° C für 110 min (bei 300 & mgr; m tief Kultur-well layer).
12. Nach dem Abkühlen legen Sie die PR-beschichteten Silizium-Wafer auf dem Mask Aligner mit UV-Licht ausgestattet.
13. Setzen Sie den PR beschichteten Silizium - Wafer mit dem UV - Licht (365 nm) in einer Dosis von 250 mJ / cm ² (27 & mgr; m dicken Muster) und 700 mJ / cm ² (300 & mgr; m dicken Muster).
14. Backen Sie die Wafer bei 95 ° C für 5 min (27 & mgr; m dicken Muster) und 30 min (300 & mgr; m dicken Muster) sind.
15. Waschen Sie die nicht vernetzten PR durch die PGMEA für 6 min (27 & mgr; m dicken Muster) und 25 min (300 & mgr; m dicken Muster) ab, bzw., und dann trocknen Sie sie mit Stickstoffgas.
16. Messen Sie die Höhe der Muster-Funktionen aufder Wafer mit einem Scanning-Laser-Profilometer, indem der Wafer auf dem XY-Tisch eines abtastenden Laser-Profilometer platzieren.
    1. Stellen Sie die Brennebene deutlich das Muster zeigen, auf dem Wafer verfügt mit dem "Kameraansicht" Beobachtungsmodus unter einem 20X Objektiv.
    2. Schalten Sie den Beobachtungsmodus von "Kameraansicht" auf "Laser-Ansicht", und stellen Sie die oberen und unteren Positionen der Merkmale.
    3. Stellen Sie den Messmodus, Bereich, Qualität und z-Pitch bis transparent (oben), 1 Zeile (1.024 x 1), mit hoher Genauigkeit und 0,5 & mgr; m sind, und drücken Sie dann die Start unten, um die Messung zu beginnen.

2. Herstellung von PDMS-Geräte für Einzelzell-Isolierung

1. Vor PDMS Gießen, silanisieren die Urformen mit Trichlorsilan eine hydrophobe Oberfläche zu schaffen, die es leichter zu schälen die PDMS Repliken von den Urformen macht.
   1. Legen Sie die Urformen und einen Gewichtungs Schiffchen mit200 & mgr; l von Trichlorsilan in einem Exsikkator und gelten Vakuum (-85 kPa) für 15 min.
   2. Stoppen Sie das Vakuum und dann die Stammformen im Exsikkator verlassen für mindestens 1 Stunde die Urformen bei Raumtemperatur silanisieren.
   3. Entfernen Sie die Urformen aus dem Exsikkator und platzieren Sie jede Master-Form in einer 10 cm Petrischale.
2. Mischen Sie eine Gesamtmenge von 17,6 g PDMS-Polymer-Kit eine Basis und einen Härter in einem Verhältnis von 10: 1 enthält, und dann gießen Sie die PDMS auf die Urform in der Petrischale.
3. Legen Sie die Petrischale in einem Exsikkator und gelten Vakuum (-85 kPa) für 1 h Luftblasen in den PDMS zu entfernen.
4. Entfernen Sie die Petrischale aus dem Exsikkator und legen Sie sie in einem herkömmlichen Ofen bei 65 ° C für 3-6 Stunden die PDMS zu heilen.
5. Entfernen des ausgehärteten PDMS Replikate aus den Stammformen und Punch zwei Löcher als Einlass und einen Auslass an den beiden Enden des Mikrokanals auf der capture-Well Array PDMS Replik durch eine Stanze mit einem Innendurchmesser von 0.75 mm für den fluidischen Kanal (2A).
6. Verwenden Sie Klebeband um die Oberfläche der PDMS-Repliken zu reinigen, und dann die PDMS-Repliken in einem Plasma-Reiniger für kurze Sauerstoffplasmabehandlung (100 Watt für 14 sec).
7. Entfernen Sie die PDMS-Repliken aus der Sauerstoffplasma-Maschine.
8. Richten Sie eine Top (mit den Capture-Mikrotitervertiefungen) und eine untere PDMS (mit den Kultur Mikrotiterstreifen) Replik von Hand unter einem Stereomikroskop und bringt sie in Kontakt.
9. Platzieren der ausgerichteten PDMS Replikate in einem Ofen bei 65 ° C für 24 h dauerhafte Verbindung zwischen den PDMS Repliken zu erreichen, um die endgültige Vorrichtung zu bilden.
10. Genießen Sie die PDMS-Gerät in einem deionisierten (DI) -Wasser gefüllten Behälter und stellen Sie den Behälter in einem Exsikkator unter Vakuum (-85 kPa) für 15 Minuten Luft aus dem Mikrokanal des PDMS-Gerät zu entfernen.
11. Legen Sie das DI-Wasser gefüllten PDMS-Gerät in einer Gewebekultur Haube und verwenden UV-Licht (Wellenlänge des Lichts: 254 nm) der Vorrichtung zu sterilisieren 30 min.
12. Ersetzen den DI-Wasser in der PDMS-Gerät mit einer 5% Rinderserumalbumin (BSA) in 1x PBS-Lösung und Inkubation für 30 min bei 37 ° C-Zellen zu verhindern, auf die Oberfläche PDMS kleben.
    Hinweis: Die BSA-Beschichtung kritisch ist die Übertragungseffizienz von isolierten Zellen von der Aufnahme-gut zu kultur gut zu verbessern.
13. Ersetzen Sie die 5% BSA-Lösung in der PDMS-Gerät mit sterilisiertem 1x PBS-Lösung.

3. Herstellung von Einzelzellsuspension

1. Kultur neurale Stammzelle KT98 und menschliche Karzinomzell A549 und MDA-MB-435 wir in Petrischale in konventionellen Zellkulturbrutschrank (37 ° C, 5% CO ₂ und 95% Luftfeuchtigkeit) Zellen für die PDMS Vorrichtungszelle Experiment vorzubereiten .
2. Entfernen und entsorgen Sie die verbrauchte Kulturmedium (DMEM Basismedium versorgt mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Antibiotika) aus der Kulturschale mit Zellen auf 70 gewachsen - 80% Konfluenz.
3. Waschen Sie sich leicht die Zellen mit sterilisiertem PBS dreimal.
4. Entfernen und entsorgen Sie die PBS und 2 ml eines rekombinanten Enzymmischung mit proteolytischen, kollagenolytischer und DNase Aktivitäten (bitte die Materialliste für die detaillierte Informationen).
5. Inkubieren der Kulturschale bei Raumtemperatur für 5 min und dann auf die Kulturschale Abgriffzelle Ablösung zu erleichtern.
6. 4 ml sterilisiertem PBS Zellen zu dispergieren, und dann übertragen die Zellsuspension in ein 15 ml konischen Röhrchen.
7. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 g für 3 Minuten und entfernen Sie den Überstand.
8. Resuspendieren vorsichtig das Zellpellet in 1 ml sterilisiertem PBS und zählen Sie die Live - Zellzahl ¹³ den Standard Trypanblau Ausschlussverfahren.
   Hinweis: Dieser Aufwirbelung Schritt zur Herstellung von gut distanzierte Einzelzellsuspension kritisch ist es, die Einzelzellisolierung Effizienz zu verbessern.

4. Single-Zell-Isolierung und Geklonte Kultur

1. Last 50 ul Zellsuspension in einer Konzentration von 2,2 bis 2,5 x10 ^{6 Zellen / ml in den Mikrokanal des PDMS - Gerät über die Austrittsöffnung des Gerätes mit einer Handpipette.
   Hinweis: Die Zellsuspension Lade Pipette werden muss angehalten und an der ersten Stoppposition gehalten zu vermeiden Luftblasen in den Mikrokanal eingeführt wird.}
2. Laden Sie weitere 50 ul Zellsuspension durch das Einlassloch gleichmäßig den gesamten Mikrokanal mit Zellen füllen.
3. Verschließen Sie die Austrittsöffnung mit einem Stopfen (3 mm lang, 1 mm Durchmesser geschnitten Nylon Angelschnur) um den Fluss zu vermeiden, induziert durch hydrostatischen Druck aus den Tröpfchen auf Eintritts- und Austrittslöcher.
   Hinweis: Die Stecker UV in einer Gewebekultur Haube sterilisiert waren vor der Verwendung.
4. Füllen Sie eine 1 ml sterile Spritze mit Kulturmedium nach oben, werfen Luftblasen aus es und setzte es auf eine Spritzenpumpe auf.
5. Schließen Sie das Medium geladen Spritze mit dem Einlassloch des PDMS-Gerät über einen 23 G stumpfe Nadel und einem Poly-tetrafluorethen (PTFE) Schläuche.
6. Ziehen Sie den Stecker aus der Steckdose Loch und alleow eine 2-Minuten Zeitintervall, damit die Zellen in die Single-Cell-Capture-Brunnen durch die Schwerkraft zu regeln.
7. Waschen der nicht erfaßten Zellen mit 300 & mgr; l Kulturmedium mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 600 ul / min entfernt von der Spritzenpumpe angetrieben.
8. Warten für 2 min um das Gerät zu stabilisieren, und Abdichten der Eintritts- und Austrittsöffnungen mit Stopfen einen geschlossenen Kultursystem zu bilden.
9. Drehen Sie das Gerät mit der Hand die aufgenommenen Einzelzellen auf die Kultur Mikrotitervertiefungen zu übertragen.
10. Legen Sie die PDMS-Gerät in einem 100-mm-Gewebekulturschale, und dann werden 10 ml sterilisiertem PBS um das Gerät Kulturmedium Verdampfen aus dem Mikrokanal zu vermeiden.
11. Bewegen der Kulturschale mit einem herkömmlichen Zellkulturbrutschrank (37 ° C, 5% CO ₂ und 95% Luftfeuchtigkeit) für klonale Kultur der einzelnen Zellen.

5. Kulturmedium Replenishment

1. Nach 1 d der Kultur, ersetzen Sie das Kulturmedium in der PDMS-Gerät mit frischem Medium Zelle pr zu verbessernoliferation.
2. Platzieren zwei Tröpfchen von Kulturmedium auf der Oberseite des PDMS-Gerät in der Nähe der Eintritts- und Austrittsöffnungen Bereiche Einführen von Luftblasen in den Mikrokanal zu vermeiden, während der nächste Schritt durchgeführt wird.
3. Stanzen zwei Löcher von der Oberseite der PDMS Vorrichtung in der Nähe der beiden Enden des Mikrokanals als Einlass und einem Auslass für den Mikrokanal.
   Hinweis: Verwenden Sie nicht durch die ganze zwei Schichten des PDMS Gerät Punch; statt, Punsch nur durch die oberste Schicht des PDMS.
4. Schließen Sie eine 1-ml-Plastikspritze mit frischem Medium mit dem Einlass über eine 23 G stumpfe Nadel und PTFE-Schlauch.
5. Strom 120 & mgr; l frisches Medium in das Gerät für 5 min das alte Medium zu ersetzen.
6. Legen Sie zwei Stecker den Ein- und Austrittslöcher abzudichten, und schicken Sie das Gerät an die Zellkultur-Inkubator.
7. Aktualisieren das Kulturmedium alle 2 d während der Dauer der Kultur durch die Verschlussstopfen zu entfernen, gefolgt von den Schritten von 5,4 bis 5,5 zu wiederholen.

Ergebnisse

Die mikrofluidische Plattform für Einzelzellisolierung und Kultur umfasst einen Mikrokanal (200 & mgr; m in der Höhe) mit zwei Sätzen von Mikrovertiefungsanordnungen (2A). Die zwei Sätze von Mikrovertiefungsarrays werden als capture-Well (25 um Durchmesser und 27 um Tiefe) und Kultur-Well (285 & mgr; m im Durchmesser und 300 & mgr; m in der Tiefe) bezeichnet für die Einzelzell-Isolierung und Kultur sind und jeweils Capture-gut ist in der Mitte einer Kult...

Diskussion

Mikrowell-basierten Gerätesysteme ^6,14 wurden für die Einzelzell - Manipulation und Analyse, wie beispielsweise großflächige Einzelzelle verwendet und ⁶ einzigen hämatopoetischen Stammzellproliferation Trapping ^15. Obwohl gut Größe, Anzahl und Form können für spezifische Anwendungen angepasst werden, die Einzelzellisolierung Effizienz wird immer gefährdet , wenn die Größe des Bohrlochs erhöht. ^9,15

Um diese Einschränkung zu überwinde...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AutoCAD software	Autodesk	AutoCAD LT 2011	Part No. 057C1-74A111-1001
Silicon wafer	Eltech corperation	SPE0039
Conventional oven	YEONG-SHIN company	ovp45
Plasma cleaner	Nordson	AP-300	Bench-Top Plasma Treatment System
SU-8 50 negative photoresist	MicroChem	Y131269
SU-8 100 negative photoresist	MicroChem	Y131273
Spin coater	Synrex Co., Ltd.	SC-HMI 2" ~ 6"
Hotplate	YOTEC company	YS-300S
Msak aligner	Deya Optronic CO.	A1K-5-MDA
SU-8 developer	Grand Chemical Companies	GP5002-000000-72GC	Propylene glycol monomethyl ether acetate
Scanning laser profilometer	KEYENCE	VK-X 100
Trichlorosilane	Gelest, Inc	SIT8174.0	Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.
Desiccator	Bel-Art Products	F42020-0000	Space saver vacuum desiccator 190 mm white base
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit	Dow corning	Sylgard 184
Harris Uni-Core puncher	Ted Pella Inc.	15072	with 0.75 mm inner-diameter
Removable tape	3M Company	Scotch Removable Tape 811
Stereomicroscope	Leica Microsystems	Leica E24
Bovine serum albumin (BSA)	Bersing Technology	ALB001.500
DMEM basal medium	Gibco	12800-017
Fetal bovine serum	Thermo Hyclone	SH30071.03HI
Antibiotics	Biowest	L0014-100	Glutamine-Penicillin-Streptomycin
Recombinant enzyme mixture	Innovative cell technology	AM-105	Accumax
DiIC12(3) cell membrane dye	BD Biosciences	354218	Used as a cell tracker
Syringe pump	Harvard Apparatus	703007
Plastic syringe (1 ml)	BD Biosciences	309659
23 gauge blunt needles	Ever Sharp Technology, Inc.	TD21
Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing	Ever Sharp Technology, Inc.	TFT-23T	inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm