Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Zusammenfassung

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca²⁺-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Einleitung

In der medizinischen Forschung wird viel Aufmerksamkeit auf Membranproteine ​​fokussiert, entweder intrinsisch oder extrinsisch, in einer Vielzahl von Lipid-Wechselwirkungen beteiligt. Arbeiten mit lipidinteragierenden Proteinen enthält entweder einen Ersatz zu den Lipiden der Auswahl wie Detergenzien, amphipols ¹ oder kleinen Proteinen ² oder eine Membran Ersatz zu finden , die das Protein löslich und aktiv hält. Lipoic Membran Ersatzstoffe sind Liposomen und Nanoscheiben (ND) , ^{3, 4.}

Nanoscheiben sind nahezu native Membranplattform....

Protokoll

1. Herstellung von Nanoscheiben

1. Expression und Reinigung des Membrangerüstprotein ^{8, 35}
   1. Express das His-Tag MSP1E3D1 in den E. coli BL21 (DE3) T1R pRARE2 Stamm in Flaschen. Bereiten Sie eine 50-ml-Übernachtstarterkultur mit LB-Medium, ergänzt mit 50 ug / ml Kanamycin bei 37 ° C. Verdünnen Sie die über Nacht Starterkultur in 2 l Terrific Broth-Medium mit 50 ug / ml Kanamycin.
   2. Wachsen die Zellen bei 37 ° C , bis die optische Dichte bei 600 nm (OD ₆₀₀₎ erreicht ca. 3 die Proteinexpression bei 18 ° C Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) für 3 h mit 0,5 mM I....

Ergebnisse

Die Methode, die wir vorschlagen, ist abhängig von der Herstellung von Nanoscheiben Bindung der Membranoberfläche für monotopen Membran-Protein bereitzustellen. Da es keine Transmembranprotein in die Lipid - Doppelschicht nanodisc eingebettet ist, werden die Nanoscheiben hier als "leere Nanoscheiben" (2A) bezeichnet. Diese weisen ein berechnetes Molekulargewicht von 256 kDa für eine Zusammensetzung von zwei MSP1E3D1 Gerüstproteine und etwa 260 Moleküle vo.......

Diskussion

Das Verfahren kann in drei Teile unterteilt werden: die Rekonstitution von leeren Nanoscheiben, die Herstellung von Protein-nanodisc Komplexe und die negative Färbung für die TEM dieser Komplexe. Jeder Teil wird separat in Bezug auf Beschränkungen der Technik, wichtige Schritte, und nützliche Änderungen gerichtet.

Die Rekonstitution von leeren Nanoscheiben. Kritische Schritte und Einschränkungen in der Herstellung und Verwendung von Nanoscheiben.

Für die Hers.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transmission electron microscope: JEOL2100F	JEOL
CCD camera	Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger	Baltec
TEM grid: 400 mesh	TAAB	GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5	Agilent Technologies	5190-2526
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare Life Sciences	17-5172-01
Plasmid:MSP1E3D1	Addgene	20066
Bacteria: BL21DE3	NEB	C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2	Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose	Sigma Aldrich	A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 ml	GE Healthcare Life Sciences	17-5247-01
Lipid:POPC	Avanti polar lipids	850457C	25 mg/ml in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin	Bio-Rad	1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm	Pall life sciences	PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate	Sigma Aldrich	31648
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Bio-Rad	161-0301
Protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	4693132001
TCEP	Sigma Aldrich	646547
Detergent: Sodium cholate hydrate	Sigma Aldrich	C6445-10G
Sodium Cholate	500 mM Sodium cholate		Resuspend in miliQ water and store at -20°C
Lipid Stock	50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl		Store at 4°C for a week or Store -80°C for a month, after purging the solution with nitrogen
MSP standard buffer	20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mMEDTA		Store at 4°C
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer	50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8	BN2001	Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer	50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8 0.002% Coomassie G-250	BN2002	Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis 4X Sample loading Buffer	50 mM BisTrispH 7.2, 6N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S	BN2003	Purchased from Thermofisher Scientific
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer	25 mM Tris-HCl pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1 % (w/v) SDS		Inhouse receipe
Denaturaing Electrophoresis 5X Sample loading Buffer	0.05 % (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl pH 6.8, 20 % (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS,10 mM 2-mercaptoethanol		Inhouse receipe
Terrific broth	Tryptone - 12.0g Yeast Extract - 24.0g 100 mL 0.17M KH2PO4 and 0.72M K2HPO4 Glycerol - 4 mL		Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 ml and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium