Räumliche und zeitweilige Kontrolle der Murine Melanom-Initiation aus Mutant Melanocyte Stammzellen

Zusammenfassung

Das folgende Verfahren beschreibt eine Methode zur räumlichen und zeitlichen Kontrolle der melanozytischen Tumorinitiation in der Murin-Sdorsal-Haut mit Hilfe eines gentechnisch veränderten Mausmodells. Dieses Protokoll beschreibt sowohl die makroskopische als auch die mikroskopische kutane Melanom-Annenentzündung.

Zusammenfassung

Das kutane Melanom gilt als der aggressivste Hautkrebs. Obwohl die Risikofaktoren und großen genetischen Veränderungen weiterhin mit zunehmender Tiefe dokumentiert werden, hat sich die Inzidenzrate des kutanen Melanoms in den letzten Jahrzehnten rasant und kontinuierlich erhöht. Um wirksame Präventionsmethoden zu finden, ist es wichtig, die frühen Schritte der Melanominitiation in der Haut zu verstehen. Frühere Daten haben gezeigt, dass follikuläre Melanozyten-Stammzellen (MCSCs) im erwachsenen Hautgewebe als Melanomzellen des Ursprungs wirken können, wenn sie onkogene Mutationen und genetische Veränderungen ausdrücken. Die Tumorigenese, die aus melanoma-anfälligen MCSCs entsteht, kann beim Übergang von MCSCs von einem ruhigen in einen aktiven Zustand induziert werden. Dieser Übergang in melanoma-anfälligen MCSCs kann durch die Modulation des Aktivitätszustandes von Haarfollikelstammzellen oder durch extrinsische Umweltfaktoren wie Ultraviolett-B-Werte (UV-B) gefördert werden. Diese Faktoren können im Labor durch chemische Enthaarung künstlich manipuliert werden, was den Übergang von Haarfollikelstammzellen und MCSCs von einem ruhigen in einen aktiven Zustand und durch UV-B-Exposition mit einem Benchtop-Licht bewirkt. Diese Methoden ermöglichen eine erfolgreiche räumliche und zeitliche Kontrolle der Hautmelanominitiation in der Murin-Srufenhaut. Daher werden diese in vivo-Modellsystemen wertvoll sein, um die frühen Schritte der Hautmelanom-Initiation zu definieren und könnten verwendet werden, um mögliche Methoden zur Tumorprävention zu testen.

Einleitung

Das Melanom, die bösartige Form von melanozytischen Tumoren, ist die aggressivste Krebserkrankung in der Haut, bei dem das kälteste Melanom für dieMehrzahl der Hautkrebssterben verantwortlich ist. In den Vereinigten Staaten wird Melanom häufig diagnostiziert; Es wird prognostiziert, dass es die 5^. bis 6^. häufigste Krebsart unter den geschätzten neuen Krebsfällen 2018^{2 sein}wird. Darüber hinaus zeigen die Inzidenz der Hautveränderungen in den letzten Jahrzehnten zwar den Trend zur allmählichen Reduktion, doch die inkutanen Melanominzizessraten in den letzten Jahrzehnten zeigen einenkontinuierlichen und raschen Anstieg beider Geschlechter.

Um das kahreale Melanom effizienter zu bekämpfen, ist es wichtig, die frühen Ereignisse der Melanomentwicklung aus ihren Ursprungszellen klar zu verstehen, um klinisch wirksame Präventionsmethoden besser zu identifizieren. Es ist inzwischen bekannt, dass adulte Stammzellen wesentlich zur Tumorbildung beitragen können, da die zelluläre Herkunft von Krebserkrankungen in vielen verschiedenen Arten von Organen, einschließlich Hautgewebe^3,4,5. In ähnlicher Weise können adulte Melanozyten-Stammzellen (MCSCs) in der Murin-Sruckhaut bei aberwitziger Aktivierung der Ras/Raf und Fort-Wege ⁶als Melanomzellen des Ursprungs wirken. Diese onkogenen Mutationen allein sind jedoch nicht in der Lage, die Tumorbildung aus ruhigen MCSCs effizient zu induzieren. Melanozytische Tumoren entwickeln sich schließlich, wenn MCSCs beim natürlichen Haarfahren aktiv werden. In diesem Protokoll werden wir jedoch Methoden beschreiben, um die zelluläre Aktivierung von tumoranfälligen MCSCs künstlich zu induzieren und so eine genaue Kontrolle der Melanominitiation6,7^zuermöglichen.

Durch die hier beschriebenen Methoden kann die räumliche und zeitliche Kontrolle der Hautmelanom-Initiation von tumoranfälligen MCSCs, die onkogene Braf^{V600E ausdrücken} , zusammen mit dem Verlust des Pten-Ausdrucks erfolgreich durchgeführt werden, da wir Haben zuvor berichtet6. Diese Methode beinhaltet frühere Befunde, die die Aktivierung von Haarfollikel-Stammzellen durch Depilation sowie die Exposition von Murinhaut gegenüber UV-B die Aktivierung von MCSCs, die sich auf die Haarfollikel stützen, erleichtern und die Translokation dieser Zelle Untervölkerung der interfollikulären^{Epidermis6,8, 9,10.} Diese in vivo-Modellsystemen können wertvolle Informationen darüber liefern, wie physiologische und ökologische Veränderungen den zellulären Status von melanomafreundlichen MCSCs verändern können, was wiederum zu einer signifikanten Initiation von Melanomen in der Haut führen kann.

Protokoll

Alle tierischen Verfahren werden nach dem Institutional Animal Care and Use Committee der Cornell University (IACUC) durchgeführt.

1. Vorbereitung

1. Sammeln Sie Schwanzklammern von 12 Tagen postnatalen Mäusen und verdauen in 400 μL von 0,05 N NaOH bei 95 ° C für 1 h. Vortex und fügen Sie 32 μL von 1 M Tris-HCl, pH 7. Genotyp-Mäuse nach PCR-Protokollen, die durch das Jackson Laboratory zur Verfügung gestellt werden und Mäusen mit demGenotyp von Interesse 6 identifizieren.
   - Tyr-CreER – hemizygous (+/CreER)
   - LSL-Braf^V600E – heterozygous (+/LSL-V600E)
   - Pten – homozygous flox (flox/flox)
   - LSL-tdTomato – hemizygous (+/LSL-tdTomato)
   NOTE: Primer-Sequenzen sind in der Materialtabelle enthalten.
2. Verwenden Sie einen Haarclipper (elektrischer Trimmer), um die Rückenhaut 2 bis 3 Tage vor allen unten beschriebenen Experimenten zu rasieren, und wenn Mäuse etwa 7 Wochen alt sind. Achten Sie darauf, die dünne Maus nicht mit dem elektrischen Trimmer zu beschädigen, da jede Verletzung eine Wundheilungsreaktion hervorrufen kann, die Haarfollikel-Stammzellen, einschließlich MCSCs, aktiviert.
3. Bestimmen Sie, ob der Haarzyklus in Telogen ist und ob die Haut während der Wartezeit verletzt wird. Wenn die Haut Anzeichen einer Verletzung zeigt, sollte die Maus nicht für diese Verfahren verwendet werden.
   NOTE: Obwohl der Haarzyklus leicht zwischen genetischen Hintergründen unterscheiden kann, befindet sich der Haarzyklus in der Rückenhaut in der Regel im Telogenzustand11. Das Tyr-CreER Transgene wird MCSCs in Telogenhaut ins Visier nehmen, und die anschließenden genetischen Veränderungen werden dauerhaft in allen Linien des MCSC ausgedrückt, einschließlich differenzierter Melanozyten und melanozytischer Tumoren.

2. Tamoxifen Behandlung für Cre-Lox genetische Rekombination

1. Vorbereitung von Tamoxifen für die intraperitoneale Injektion (IP) oder die topische Verabreichung für systemische oder lokalisierte genetische Rekombination
   NOTE: Damit Tamoxifen Rekombination herbeiführen kann, muss es zunächst von der Leber zu 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) verstoffwechselt werden, das den Kreterbinden und aktivieren kann. Die topische Anwendung von Tamoxifen wird auf diese Weise nicht verstoffwechselt und 4-OHT muss direkt verwendet werden. Für eine ausreichende Rekombination ist nur eine Methode der Tamoxifen-Lieferung erforderlich.
   1. Tamoxifen: Tamoxifen bei einer Konzentration von 10 mg mL-1 in Maisöl^aufgelöst . Um bei der Auflösung des Medikaments in Lösung zu helfen, addieren Sie bis zu 10% das Gesamtvolumen von 100% molekularem Ethanol zu dem Medikament in Pulverform, Wirbel für 3 min und fügen Sie dann das restliche Volumen von Maisöl hinzu. Weiter auf den Wirbel, bis kristallines Material in der Lösung nicht mehr erkennbar ist. Die Tamoxifen-Lösung kann durch einen 0,2 μm Filter sterilisiert werden. Gehen Sie zu Schritt 2.2.1 für die Behandlung.
   2. 4-OHT: Bereiten Sie eine Bestandslösung von Hydroxytamoxifen bis zu 3 mg mL^-1 in 100% Ethanol vor. Dann kann eine funktionierende Lösung so weit wie nötig angewendet werden, um den Hautbereich zu erfassen (in der Regel eine einzige Anwendung).
      NOTE: Eine Bestandslösung von Hydroxytamoxifen kann bei einer Endkonzentration von 5 mM in 100% Ethanol aufgelöst werden. Um eine Arbeitslösung vorzubereiten, können dann 5 μL von 4OH-tamoxifen Lagenlösung in 15 μL 100% Ethanol verdünnt werden. Für 4 mm 2-Bereich^können 1 bis 3 μL Arbeitslösung topisch aufgetragen werden.
2. Behandlung von Mäusen mit Tamoxifen entweder systemisch oder topisch
   1. Für die systemische Behandlung 2 mg Tamoxifen über IP-Injektion einmal täglich für 3 Tage mit einer 26 G-Nadel verabreichen.
      NOTE: Mit diesem Modell sind etwa 93% ± 4% der ruhigen MCSCs mit tdTomato⁶gekennzeichnet.
   2. Für die regionale Aktivierung, führen Sie eine topische Behandlung mit 4-OHT. Mit der Arbeitslösung wird der Hautbereich bedecken. Die Höhe der Arbeitslösung kann durch die Größe der Interessenregion bestimmt werden, wie sie in Schritt 2.1.2 beschrieben wird.
3. Bei 48 Stunden nach der letzten Dosis Tamoxifen, gehen Sie zu Schritt 3 für die chemische Depilation induzierte Tumor-Initiation oder zu Schritt 4 für UV-B-induzierte Tumor-Initiation

3. Chemische Depilation

1. Ausrüsten Sie einen Mausbehandlungsraum, der ein Isoofluran-System enthält, mit den folgenden notwendigen Materialien: Haarentfernungscreme, Baumwollschwaben, Papiertuch und Wasser.
2. Legen Sie die Maus in die Induktionskammer und Betäubung mit 3,5 bis 4,5% Isofluran und 1 L/min Sauerstoff.
3. Sobald sich die Atemfrequenz stabilisiert hat, bestätigen Sie, dass sich die Maus in der richtigen Ebene der Anästhesie befindet, indem Sie eine Zehenspinke durchführen und die Maus auf das Hauptrohr übertragen, das Anästhesie mit 1 bis 1,5% isoflurane und 1 L/min Sauerstoff aufrecht erhält. Verwenden Sie die Augensalbe, damit die Augen unter Anästhesie vor dem Trocknen bewahrt werden.
4. Verwenden Sie einen Wattestäbchen, um eine dünne Schicht Haarentfernungscreme auf den rasierten Bereich der Maus Haut aufzutragen.
5. Sobald die Creme gleichmäßig aufgetragen wurde, verwenden Sie saubere Wattestäbchen, um mit der Entfernung zu beginnen. Die Gesamtzeit, die die Creme mit der Haut in Kontakt setzt, sollte 1 min nicht überschreiten.
6. Die Haut mit einem feuchten Papiertuch sanft abwischen und dafür sorgen, dass jede Restcreme entfernt wurde.
   NOTE: Haarentfernungscreme kann bei einer vollständigen Entfernung zu Reizungen der Haut führen. Einige Mäuse, wie zum Beispiel solche auf einem C57BL/6 Hintergrund, können anfällig für die Entwicklung von Dermatitis¹²sein. Obwohl selten, einige Tiere werden Dermatitis innerhalb von 24 Stunden nach Haarentfernung Creme Anwendung oder mechanische Depilation zu entwickeln. Achten Sie darauf, die Mäuse am Tag nach der Behandlung zu überprüfen, um nach Anzeichen von regionalen Hautreizungen zu suchen.
7. Die entnommenen Haarwellen und alle Materialien, die in einen Bioasikörbe verwendet werden, verwerfen.
8. Legen Sie die Maus in einen leeren, sauberen Mauskäfig, bis die Anästhesie abgenutzt ist.
9. Bringe die Mäuse in ihre Käfige zurück.

4. UV-B-Irstrahlung

1. Rüsten Sie einen Mausbehandlungsraum aus, der ein Isoofluran-System mit den folgenden benötigten Materialien enthält: UV-B-Lichtsystem, UV-B-Lichtmesser, Schutzhülle für die Maus, zusätzliche UV-B-SchutzpSA für Forscher und eine Zeitschaltuhr.
2. Die Mäuse sollten mit der UV-B-Dosis bestrahlt werden (d.h. 0-180 mJ/cm2). Mit dem UV-B-Lichtmesser wird die passende Zeit für die Bestrahlung der Mäuse ermittelt.
   NOTE: mW/cm 2 x time = dose
3. Die Maus mit Isooflurane betäuben. Während in der Induktionskammer, verwenden Sie 3,5 bis 4,5% isofluran und 1 L/min Sauerstoff.
4. Sobald die Maus stabilisiert ist, bestätigen Sie die Anästhesieeffekte mit einer Zehenspinose und übertragen Sie die Maus auf das Hauptanästhesie-Rohr in der UV-Kammer. Verwenden Sie die Augensalbe, um zu verhindern, dass die Augen unter Anästhesie trocknen. Anästhesie mit 1 bis 1,5% isoflurane und 1 L/min Sauerstoff aufbewahren.
5. Die Rückenhaut mit UV-B-Schutzmaterial bedecken, so dass nur die gewünschte Region freigelegt wird.
   NOTE: Zu diesem Zeitpunkt sollte die entsprechende PSA genutzt werden. Die Dauer der Bestrahlung der Maus hängt von der Intensität der verwendeten Glühbirne ab, aber die Anästhesie muss überwacht werden, wenn die benötigte Zeit 30 s überschreitet.
6. Bedecken Sie die UV-Kammer mit UV-beständigem Deckel oder anderen geeigneten Materialien.
7. Schalten Sie die UV-B-Lampe ein und bestrahlen Sie die Maus für die von Forschern für das jeweilige Ziel festgelegte Zeit.
8. Schalten Sie das UV-System und Isoofluran aus, dann legen Sie die Maus in einen leeren Mauskäfig, bis die Anästhesie abgenutzt ist.
9. Bringe die Mäuse in ihre Käfige zurück.

5. Tissue Processing

1. Hautisolierung
   1. Vor dem Start: Nekropsie-Instrumente, Filterpapier und Papierhandtücher.
   2. Sterbegänglich die Mäuse nach IACUC-zugelassenen Protokollen und bestätigen den Tod vor dem Vorgehen.
   3. Mit einem Haarclipper, rasieren Sie alle Haare aus dem Rückenbereich der Haut. Den Bereich mit einem lintfreien Gewebe leicht bepinseln, um den Bereich zu reinigen.
   4. Machen Sie einen kleinen Schnitt mit scharfer Schere knapp über dem Ansatz des Schwanzes.
   5. Fügen Sie große stumpfe Scheren in den Schnitt ein und trennen Sie die subdermalen Bindegewebe.
   6. Isolieren Sie die von Interesse gestorbene Hautregion vorsichtig, indem Sie mit scharfer Schere am Rand des Gewebes schneiden.
   7. Legen Sie das Hautgewebe auf ein sauberes Papiertuch und ziehen Sie mit stumpfen Zangen die Haut so aus, dass sie sich an das Handtuch hält und gelehrt wird. Dieser Schritt dient dazu, das Gewebe zusätzlich zu unterstützen, damit es manipuliert und verarbeitet werden kann, während es seine Form behält.
      NOTE: Achten Sie darauf, nur die äußeren Bereiche des Hautgewebes zu behandeln, da die Zangen Schäden an der Haut verursachen können, die histologisch gesehen werden können.
2. Fixierung der Gewebe
   1. Ein Stück Filterpapier halbieren und entsprechend abmalen. Legen Sie die Haut zusammen mit Papierhandtuchuntergrund in das gefaltete Papier direkt neben die Falte, so dass die Probe glatt ist und nicht gefaltet oder zerbröselt. Das Filterpapier durch das Anziehen der offenen Seiten versiebenhalten und dann so schneiden, dass das restliche Papier für zukünftige Proben verwendet werden kann.
      NOTE: Dieser Schritt wird so durchgeführt, dass die Haut ihre Form während der Fixierung behält.
   2. Die Gewebeprobe vollständig in 10% neutrales, gepuffertes Formalin für 3 bis 5 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C untertauchen.
   3. Nach der Fixierung die Proben aus Formalin entfernen, in deionisiertes Wasser waschen (2x, 5 min) und Gewebe Blöcke herstellen. Entfernen Sie sorgfältig Restmaterial aus dem Hautgewebe (z.B. Restpapier).
3. Herstellung von gefrorenen Gewebeblöcken (Bild 1)
   1. Die Kanten der Hautprobe so zertrampeln, dass sie nicht gezackt werden und dann 3 Sagittalschnitte machen. Die Breite dieser Streifen sollte nicht mehr als die Höhe des Kryomold (5 mm) sein. Als Nächstes sollten Sie Querschnitte machen, um Teile der Haut zu haben, die nicht länger als die Breite des Kryomold (20 mm) sind und eingebettet werden können. Wiederholen Sie die restliche Hälfte der Rückenhaut, oder speichern Sie das Gewebe für andere Anwendungen (abwechselnd die Hälfte vor der Fixierung speichern).
      NOTE: Es ist wichtig, die Hautstücke in der richtigen Ausrichtung zu halten.
   2. Orient die Kryomold (25 x 20 x 5 mm3) in einer Porträtorientierung und platzieren Sie 4 bis 5 Stück Haut auf dem OCT. Sobald alle Stücke vorhanden sind, verwenden Sie 2 Paar feine Zangen, um den langen Rand der Haut auf den Boden der Kryomold zu bringen. Die Haut sollte nun im OCT senkrecht zur Basis der Form stehen. Achten Sie darauf, die Bildung von Lufttaschen innerhalb des OCT während dieses Schrittes zu minimieren (Abbildung1).
   3. Füllen Sie die Form mit OCT an die zweite Lippe, und legen Sie auf die flache Oberfläche von Trockeneis. Verwenden Sie Zangen, um alle Hautstücke, die während der Übertragung verschoben haben können, während der Block beginnt zu frieren. Sobald die untere Schicht verfestigt ist, ist eine Manipulation des Gewebes unmöglich.
   4. 8-10 μm Dias für die Analyse schneiden.
4. Formalin fixierte Paraffin-Embedded (FFPE) Gewebeblöcke
   1. 2 Stück feste Haut in eine beschriftete Kassette geben und in zunehmendem Ethanol dehydrieren (75% Ethanol für 30 min, 85% für 30 min, 90% für 30 min, 95% für 30 min, 100% für 2x 30 min, Xylen-oder Xylen-Ersatz für 2x 30 min). Mit Paraffin bei 58-60 °, zuerst für 30 min, und dann über Nacht, in die Inkubate.
   2. Einbetten in eine 24 x 24 mm 2 Edelstahl-Gewebeform mit flüssigem Paraffin und bei-5 ° C. Die Gewebeorientierung sollte der von gefrorenen Gewebeblöcken ähnlich sein, so dass Längsabschnitte über mehrere Haarfollikel visualisiert werden können (Abbildung1).
   3. Sobald sich das Paraffin verfestigt hat, entfernen Sie die Form und schneiden Sie sie in 5-10 μm-Abschnitte für die Analyse.

Ergebnisse

Hautmelanom-Initiation durch chemische Depilation

Das Verfahren der chemischen Depilation ist in Abbildung2 dargestellt. Wenn Mäuse 7-Wochen postnatal sind, ist ihre Rückenhaut in Telogen. Bei Telogen sind Haarfalzen-Stammzellen und MCSCs in einem ruhigen, ruhenden Zustand. Die Haut sollte nach der Rasur kein signifikantes Haarwachstum aufweisen. Auf der anderen Seite kann die che...

Diskussion

Hallmarkische genetische Veränderungen, die häufig bei Hautmelanomtumoren vorkommen, wurden gutbeschrieben. Die dominanteste Fahrermutation ist Braf^V600E, und ein gentechnisch verändertes Mausmodell für Braf^V600E-vermitteltes Melanom wurde von der Bosenberg-Gruppe¹⁴ erzeugt und im Jackson Laboratory deponiert. Anhand dieses Mausmodells hat unsere aktuelle Studie die Notwendigkeit einer zellulären Aktivierung von tumoranfälligen ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamoxifen	Sigma	T5648-1G	For systemic injection
Tamoxifen	Cayman Chemical	13258	For systemic injection
Corn oil	Sigma	45-C8267-2.5L-EA
4OH-tamoxifen	Sigma	H7904-25MG	For topical treatment
26 G 1/2" needles	various		Veterinary grade
1 mL syringe	various		Veterinary grade
Pet hair trimmer	Wahl	09990-502
Hair removal cream	Nair	n/a	Available at most drug stores
Cotton swabs	various
Ultraviolet light bulb	UVP	95-0042-08	model XX-15M midrange UV lamp
200 proof ethanol	various		pure ethanol
Histoplast PE	Fisher Scientific	22900700	paraffin pellets
Neutral Buffered Formalin, 10%	Sigma	HT501128-4L
Clear-Rite 3	Thermo Scientific	6901	xylene substitute
O.C.T. Compound	Thermo	23730571
Tissue Cassette	Sakura	89199-430	for FFPE processing
Cryomolds	Sakura	4557	25 x 20 mm
FFPE metal mold	Leica	3803082	24 mm x 24 mm
Isoflurane	various		Veterinary grade
Anesthesia inhalation system	various		Veterinary grade
Fine scissor	FST	14085-09	Straight, sharp/sharp
Fine scissor	FST	14558-09	Straight, sharp/sharp
Metzenbaum	FST	14018-13	Straight, blunt/blunt
Forcep	FST	11252-00	Dumont #5
Forcep	FST	11018-12	Micro-Adson
Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f	Jackson Labs	13590
LSL-tdTomato	Jackson Labs	007914	ai14
Cre-1		n/a	GCATTACCGGTCGATGCAACGA GTGATGAG
Cre-2		n/a	GAGTGAACGAACCTGGTCGAA ATCAGTGCG
Braf-V600E-1		n/a	TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC
Braf-V600E-2		n/a	CTCTGCTGGGAAAGCGGC
Kras-G12D-1		n/a	AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT AAGTCTGCA
Kras-G12D-2		n/a	CCTTTACAAGCGCACGCAGACT GTAGA
Pten-1		n/a	ACTCAAGGCAGGGATGAGC
Pten-2		n/a	AATCTAGGGCCTCTTGTGCC
Pten-3		n/a	GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC
tdTomato-1		n/a	AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA
tdTomato-2		n/a	CCGAAAATCTGTGGGAAGTC
tdTomato-3		n/a	GGCATTAAAGCAGCGTATCC
tdTomato-4		n/a	CTGTTCCTGTACGGCATGG