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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur minimalen Volumenverglasung unreifer Katzenoozyten mit im Labor hergestellten Medien auf kommerziellen Trägern. Es deckt jeden Schritt von der Eizellenisolierung von ex vivo Gonaden bis zur Verglasung und Erwärmung ab.

Zusammenfassung

In den Erhaltungsprogrammen für Wildtiere ist Das Gamete Banking von entscheidender Bedeutung, um die genetischen Ressourcen wertvoller Individuen und seltener Arten zu schützen und die Erhaltung der biologischen Vielfalt zu fördern. Bei Feliden sind die meisten Arten vom Aussterben bedroht, und heimische Rassen werden als Modell verwendet, um die Effizienz von Protokollen für das Keimplasma-Banking zu erhöhen. Unter den Eizellen-Kryokonservierungstechniken ist die Verglasung in der humanen und tierärztlichen assistierten Reproduktion immer beliebter. Die Cryotop-Verglasung, die zunächst für menschliche Eizellen und Embryonen entwickelt wurde, hat sich als gut für Katzenoozyten geeignet erwiesen. Diese Methode bietet mehrere Vorteile, wie die Machbarkeit unter Feldbedingungen und die Geschwindigkeit des Verfahrens, die hilfreich sein können, wenn mehrere Proben verarbeitet werden müssen. Die Effizienz hängt jedoch stark von den Fähigkeiten des Bedieners ab, und es sind eine labor- und laborübergreifende Standardisierung sowie eine Personalschulung erforderlich. Dieses Protokoll beschreibt minimale Volumen verglasung von unreifen Katzenoozyten auf einer kommerziellen Unterstützung in einem Schritt für Schritt feldfreundliches Protokoll, von der Oozytensammlung bis zur Erwärmung. Nach dem Protokoll, Erhaltung der Oozytenintegrität und Lebensfähigkeit bei Erwärmung (bis zu 90%) zu erwarten, obwohl es noch Raum für Verbesserungen bei der Reifung nach der Erwärmung und den Ergebnissen der embryonalen Entwicklung gibt.

Einleitung

Die Kryokonservierung ist zu einem wichtigen Schritt der assistierten Reproduktionstechniken (ARTs) geworden. Beim Menschen, Es ermöglicht die Erhaltung der Fruchtbarkeit oder Verschiebung der Elternschaft aus medizinischen oder persönlichen Gründen. Bei Tieren ist es notwendig, Distanz und Zeit in geplanten Paarungen zu überwinden, insbesondere bei Nutztieren und Haustieren, oder genetisches Material wertvoller Subjekte in Naturschutzprogrammen, insbesondere in wildgefährdeten Arten, zu konservieren. Gamete Kryokonservierung ist die beste Wahl, wenn die Individuen gezüchtet wurden noch nicht ausgewählt oder um ethische Fragen im Zusammenhang mit embryo nieren, vor allem in der Humanmedizin zu vermeiden1. Spermatozoen sind relativ einfach zu erhalten und geben zufriedenstellende Ergebnisse nach dem Auftauen, aber Eizellen, aufgrund ihrer strukturellen Eigenschaften, könnte komplexer zu speichern. Tatsächlich begrenzt das niedrige Oberflächen-Volumen-Verhältnis sowie das Vorhandensein der Zona-Pellucida, die das Ooplasma umgibt, die Bewegung von Kryoprotektoren und Wasser über die Zelle2. Darüber hinaus sind sie bei Haustieren einschließlich Feliden durch ein lipidreiches Zytoplasma gekennzeichnet, das3sie empfindlicher gegenüber Kryokonservierung 3 machen soll.

Die meisten Felide sind bedroht, und die Hauskatze wird als Modell verwendet, um Protokolle zur Erhaltung von Keimplasma zu entwickeln, dank der Verfügbarkeit von Gonaden aus der routinemäßigen Ovariektomie. Bei Wildtieren können Gonaden nach Wahloperationen oder (häufiger) post-mortemgewonnen werden, und unreife (keimförmige Vesikel) Gameten können geborgen werden. Hormonelle Stimulation, die darauf abzielt, reife (Metaphase II) Eizellen zu erhalten, ist aufgrund der ethischen Fragen und der art- und individualspezifischen Reaktion auf Behandlungen4nicht so häufig wie in menschlichen ARTs.

Daher hat sich die Entwicklung von Kryokonservierungsstrategien auf unreife Gameten konzentriert, die in der Regel nach dem unerwarteten oder plötzlichen Tod seltener Personen abgerufen werden können. Aus biologischer Sicht gibt es einige Unterschiede in der Kryokonservierung von unreifen oder reifen Gameten, von denen jeder seine Vorteile hat. Erstens ist die DNA in unreifen Eizellen geschützt, deren Keimbläschen Chromosomen enthält, die von einer Kernmembran umgeben sind, während die meiotische Spindel der Metaphase II Oozyten anfälliger für Kryoverletzungen sein könnte5. Zweitens können kaltinduzierte Zytoskelettschäden die Spindelrotation, die Polarkörperextrusion, die pronukleare Migration und die Zytokinese beeinflussen, die je nach Oozytenentwicklungsphase unterschiedliche Auswirkungen haben und die Meioseprogression oder Ereignisse nach der Befruchtung beeinflussen. Schließlich, und vielleicht am wichtigsten, während reife Oozyten zur Befruchtung bereit sind, verlassen sich unreife Gameten auf die Unterstützung der umgebenden Cumuluszellen, um durch die kernnukleare und zytoplasmatische Reifung6zu gehen, und dies ist der Grund, warum ganze Cumulus-Oozytenkomplexe (COCs) kryokonserviert sind. Der Verlust von Cumuluszellen und/oder der Verlust der funktionellen Verbindung zwischen der Gamete und den umgebenden somatischen Zellen sind jedoch wahrscheinlich die schädlichste Wirkung der Kryokonservierung unreifer COCs.

Unter den Kryokonservierungstechniken ist die Verglasung eine, die leichter unter Feldbedingungen angewendet werden kann. Im Vergleich zum langsamen (oder kontrollierten) Einfrieren ist die Verglasung schneller und erfordert keine spezifischen Geräte, wie z. B. einen programmierbaren Gefrierschrank. Um die drei Grundprinzipien der Vitrifizierung (d.h. hohe Viskosität, verbunden mit hoher Kryoprotektorkonzentration, geringen Volumina und ultraschnellem Temperaturabfall) zu erfüllen, wurden mehrere Medien und Stützen entwickelt und insbesondere bei Katzen für unreife und reife Oozyten verwendet. Ausgehend von einfachen Strohhalmen7wurden dann Geräte entwickelt, um das Ziel "Minimum Volume" zu erreichen. Cryoloop8, offen gezogene Strohhalme (OPS)9, Kunststoffrinnen (modifiziertes Stroh)10 und Kryotubes11 wurden verwendet, bis ein effizienteres Gerät (d.h. Cryotop) eingesetzt wurde11, verbesserungder Überleben und Meiose Wiederaufnahme. Cryotop (Supplemental Figure 1) ist eine kommerziell erhältliche Unterstützung, die das wahloffene System für die Vitrifizierung geworden ist. Entwickelt für die Verglasung von menschlichen Eizellen und Embryonen, besteht es aus einem kleinen Folienstreifen, der an einem Hartplastikhalter befestigt ist, geschützt durch eine Kunststoffrohrkappe während der Lagerung12. Dank ihrer Verwendbarkeit und der extremen Reduzierung des Verglasungsvolumens (nur 0,1 l), die auch zu extrem schnellen Abkühlungs- und Erwärmungsraten führt, wurde diese Verglasungsunterstützung zunehmend bei mehreren Arten angewendet, einschließlich der Hauskatze, bei der sie mit einer Vielzahl von Medien13,14,15,16,17verwendet wurde.

Der Zweck dieses Manuskripts ist es, ein Sammlungs-Vitrifizierungs-Erwärmungsprotokoll zu beschreiben, mit geringfügigen Änderungen von dem ursprünglich für menschliche Eizellen entwickelten Protokoll, das im Labor hergestellte Medien und kommerzielle Stützen für minimale Volumenverglasung verwendet und leicht unter Feldbedingungen für die Kryokonservierung unreifer feliner COCs angewendet werden kann.

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Protokoll

Die hiermit dargestellten Verfahren wurden nicht ethisch zugelassen, da Katzeneierstöcke in Tierkliniken als Nebenprodukte aus der vom Eigentümer angeforderten Routine-Ovariektomie oder Ovariohysterektomie gesammelt wurden.

1. Oozyten-Sammlung

  1. Vor Beginn der Experimente, bereiten Sie Lösungen für Dieeier- und Eizellsammlung vor. Bereiten Sie Diestöcke-Sammlungslösung mit Phosphatgepufferter Kochsaline (PBS) mit einer Mischung aus Antibiotika und Antimykotika (100 I.E./ml Penicillin G-Natrium, 0,1 mg/ml Streptomycinsulfat, 0,25 g/ml Amphotericin B) vor. Herstellung einer Eizellensammellösung (d. h. PBS/PVA) mit PBS mit 100 I.E./ml Penicillin G-Natrium, 0,1 mg/ml Streptomycinsulfat und 0,1% (w/v) Polyvinylalkohol (PVA).
  2. Lösungen für die Eierstock- und Eizellensammlung bei 4 °C bis zur Verwendung lagern.
  3. Am Tag des Spayings der Königinnen, wenige Stunden vor der Verarbeitung der Proben, nehmen Sie einen Teil der Eierstock- und Eiozyten-Sammellösungen und lassen Sie sie bei Raumtemperatur aufwärmen (RT; 25 x 2 °C).
  4. Wenn Proben ins Labor gelangen, isolieren Sie die Eierstöcke aus dem umgebenden Bindegewebe und aus dem Eileiter und waschen Sie sie in frischem Eierstocksammelmedium in einer Petrischale.
  5. Füllen Sie eine 35 mm Petrischale für jede Königin mit ca. 3 ml RT PBS/PVA und eine weitere Schale, um die Eizellen zu sammeln.
  6. Legen Sie ein Paar Eierstöcke in eine Petrischale und zerkleinern Sie den Kortex mit einem chirurgischen Skalpell. Stellen Sie sicher, dass alle Follikel mit Hilfe eines Stereomikroskops gebrochen wurden (Vergrößerung 8x).
  7. CoCs mit einer Pipette sammeln und in frischer PBS/PVA in der zugeordneten Petrischale bewegen. Wählen Sie gute Qualitäten COCs, mit einem homogenen, dunklen Zytoplasma und umgeben von mehreren kompakten Schichten von Cumuluszellen (Grad I18).

2. Vitrifizierung

  1. Vorbereiten von Gleichgewichts- und Verglasungsmedien.
    1. Herstellung der Ausgleichslösung (ES) mit 7,5 % (v/v) Ethylenglykol (EG) und 7,5 % (v/v) Dimethylsulphoxid (DMSO) in Medium 199 mit 20 % fetalem Rinderserum (FBS).
    2. Vorbereiten sie Vitrifizierungslösung (VS) mit 15% (v/v) EG, 15% (v/v) DMSO und 0,5 M Saccharose in Medium 199, mit 20% FBS (modifiziert von 19).
    3. Lassen Sie ES und VS vor gebrauchen bei RT aufwärmen.
      HINWEIS: Kryoprotektoren (z. B. EG, DMSO) sind als zytotoxisch bekannt. Eine Strategie, um ihre Toxizität entgegenzuwirken, ist die Temperatur zu reduzieren, bei der die Zellen ihnen ausgesetzt sind20, und Eizellen sind in der Regel Kryoprotektoren bei RT ausgesetzt. So wird das gesamte Verfahren, von der Eizellensammlung bis zur Verglasung, bei RT in diesem Protokoll durchgeführt, um Temperaturschwankungen zu vermeiden.
  2. Bereiten Sie die Verglasungschale (d.h. eine spezielle Schale bestehend aus sechs konischen Brunnen in zwei Reihen, bekannt als "Repro-Platte"). Bereiten Sie eine Reihe (drei Brunnen) für jede Verglasungsunterstützung vor.
    1. Fügen Sie 20 L ES auf der Unterseite des ersten Brunnens hinzu.
    2. Fügen Sie 300 l VS auf der Unterseite der zweiten (d. h. 1VS) und dritten (d. h. 2VS) Brunnen hinzu.
  3. CoCs in ES ausdematrieren.
    1. Mit einer Kleinbohrpipette (z.B. einer Pasteurpipette, die auf einem Bunsenschnabel gezogen wird, um sie dünner zu machen – der Durchmesser sollte mindestens 200 m betragen), übertragen Sie eine (oder mehrere) COC(s) auf den Boden des ersten Brunnens.
      HINWEIS: Wählen Sie die Größe der Pipette nach der Anzahl der Schichten von Cumuluszellen, die die Eizellen umgeben, also nach COCs-Dimensionen, mit dem Ziel, das Medienvolumen, das in jedem Schritt mit COCs übertragen wird, so weit wie möglich zu reduzieren. Mit dem vorliegenden Protokoll können geschulte Bediener bis zu acht Katzen-COCs pro Verglasungsunterstützung erfolgreich vitrifyieren.
    2. Fügen Sie langsam 20 L ES an der Grenze des Tropfens hinzu. Warten Sie 3 Minuten.
    3. Fügen Sie langsam weitere 20 L ES am Rand des Tropfens hinzu. Warten Sie 3 Minuten.
    4. Fügen Sie langsam 240 L ES an der Grenze des Tropfens hinzu. Warten Sie 9 Minuten.
    5. Während des Wartens eine Schachtel mit flüssigem Stickstoff (LN2)vorbereiten, eine Verglasungsunterstützung mit dem Experiment-/Katzen-Identifikationscode kennzeichnen und offen lassen. Setzen Sie beide in die Nähe des Stereomikroskops, so dass sie während der Arbeit leicht erreichbar sind.
      Vorsicht! Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung beim Umgang mit LN2.
    6. Wenn mehrere COCs verglast werden müssen, beginnen Sie alternativ den ersten Ausgleichsschritt (siehe Schritt 2.3.1 - 2.3.2) für eine andere Gruppe von COCs (die auf eine neue Verglasungsunterstützung geladen werden).
  4. Vitrify COCs in VS in weniger als 90 Sekunden.
    1. Mit der gleichen Kleinbohrpipette, füllen Sie es mit 1VS, nehmen Sie die COCs von der Unterseite des ersten Brunnens (ES) und bewegen Sie sie an die Oberfläche des zweiten Brunnens (1VS).
    2. Waschen Sie die Pipette mit 1VS.
    3. Nehmen Sie die COCs und bewegen Sie sie in einem anderen Bereich (auf der Unterseite) des Brunnens; das sie umgebende Medium mit der Pipette vermischen.
    4. Füllen Sie die Pipette mit 1VS in einem anderen Bereich des Brunnens, nehmen Sie die COCs, bewegen Sie sie und mischen Sie das Medium um sie herum mit der Pipette.
    5. Wiederholen Sie Schritt 2.4.4.
    6. Waschen Sie die Pipette mit 2VS.
    7. Nehmen Sie die COCs und bewegen Sie sie auf der Unterseite des dritten Brunnens (2VS); das sie umgebende Medium mit der Pipette vermischen.
    8. Füllen Sie die Pipette mit 2VS in einem anderen Bereich des Brunnens, nehmen Sie die COCs, bewegen Sie sie und mischen Sie das Medium um sie herum mit der Pipette.
    9. Wiederholen Sie Schritt 2.4.8.
    10. Füllen Sie die Pipette mit 2VS in einem anderen Bereich des Brunnens, nehmen Sie die COCs und laden Sie sie auf den Streifen der Verglasungsstütze, so nah wie möglich an der Spitze. Aspirieren Sie überschüssiges Medium, um das Volumen von VS so weit wie möglich zu reduzieren.
    11. Tauchen Sie sofort die Verglasungsunterstützung in LN2ein, bewegen Sie sie. Schließen Sie es mit Hilfe einiger Klemmen, um sicherzustellen, dass es immer in LN2eingetaucht bleibt.
      HINWEIS: Das richtige Timing zu halten ist aufgrund der kryoprotektoren Zelltoxizität von entscheidender Bedeutung. Aufgrund ihrer hohen Konzentration in Verglasungsmedien muss die Zellexposition auch durch einwandfreie Ausführung der Technik21kontrolliert werden. Wenn Proben reichlich vorhanden sind, sollten Sie sie teilen, um sie schneller zu verarbeiten und die Zeit von der Eizellensammlung bis zur Vitrifizierung zu minimieren.
  5. Bewahren Sie die geladenen Verglasungsstützen in einem Kelbeschunge auf und bewahren Sie sie bis zur Erwärmung in einem LN2-Tank auf.
    HINWEIS: Alle vorherigen Schritte des Protokolls können auch unter Feldbedingungen angewendet werden, wenn LN2 verfügbar ist. Ein Trockenversender wird notwendig sein, um die Proben sicher ins Labor zu transportieren und dann mit den folgenden Phasen fortzufahren.

3. Erwärmung

  1. Bereiten Sie wärmende Medien vor.
    1. Bereiten Sie auftauende Lösung (TS) mit 1 M Saccharose in Medium 199, mit 20% FBS.
    2. Bereiten Sie Verdünnungslösung (DS) mit 0,5 M Saccharose in Medium 199, mit 20% FBS vor.
    3. Bereiten Sie Waschlösung (WS) mit Medium 199 mit 20% FBS.
    4. Vor gebrauchen TS auf 38 °C und DS und WS bei RT aufwärmen.
  2. Bereiten Sie ggf. das Kulturmedium auf die spätere Anwendung erwärmter COCs (z. B. In-vitro-Reifung, IVM) vor.
  3. Stellen Sie die Heizbühne in der Nähe des Stereomikroskops auf und schalten Sie sie ein (38 °C). Legen Sie den Deckel einer Petrischale zum Aufwärmen.
  4. Wenn alles fertig ist, übertragen Sie die Verglasungsstützen, die aus dem Lagertank erwärmt werden müssen, auf eine Box mit LN2, und legen Sie die Box in der Nähe des Stereomikroskops.
  5. Bereiten Sie die "Repro-Platte" vor. Bereiten Sie eine Zeile für jede Verglasungsunterstützung vor, die erwärmt werden muss.
    1. Fügen Sie 300 l DS auf der Unterseite des ersten Brunnens hinzu.
    2. Fügen Sie 300 L WS auf der Unterseite des zweiten (d. h. 1WS) und dritten (d. h. 2WS) Brunnen hinzu.
  6. Machen Sie einen Tropfen TS (100 l) auf den Deckel der Petrischale.
  7. Öffnen Sie mit Klemmen eine Verglasungsstütze im LN2.
  8. Legen Sie den TS-Tropfen unter das Stereomikroskop und nehmen Sie mit einer schnellen Bewegung die Verglasungsunterstützung des LN2 und tauchen Sie ihren Streifen in den Tropfen ein, indem Sie ihn bewegen, bis sich alle COCs lösen. Entfernen Sie die Unterstützung aus dem Drop, sobald sie leer ist, aber lassen Sie die COCs in TS insgesamt 1 Minute (vom Eintauchen bis zum folgenden Schritt).
  9. Nehmen Sie eine Pipette ähnlich der für die Verglasung verwendet und füllen Sie sie mit DS. Nehmen Sie die COCs aus dem Tropfen (TS) und verschieben Sie sie auf den Boden des ersten Brunnens (DS). Warten Sie 3 Minuten.
  10. Waschen Sie die Pipette mit 1WS. Nehmen Sie die COCs und bewegen Sie sie auf der Unterseite des zweiten Brunnens (1WS). Warten Sie 5 Minuten.
  11. Waschen Sie die Pipette mit 2WS. Nehmen Sie die COCs und bewegen Sie sie auf der Oberfläche des dritten Brunnens (2WS). Warten Sie, bis sie den Boden des Brunnens berühren.
  12. Wiederholen Sie Schritt 3.11 mit einem anderen Bereich des Brunnens.
  13. Die Pipette mit Kulturmedium waschen und die Eizellen für die folgende Verwendung (z.B. IVM) in die Kulturschale bewegen.

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Ergebnisse

Nach der Verglasung und Erwärmung der Katze nach dem vorliegenden Protokoll (Abbildung 1 und ergänzende Abbildung 1) überlebt die überwiegende Mehrheit der Gameten. Nach der Vitrifizierung kann unter anderem die Lebensfähigkeit am optischen Mikroskop als morphologische Integrität22 oder unter Verwendung von vitalen Flecken bewertet werden. Eines der letzteren ist Fluorescein-Diacetat/Propidiumiodid (FDA/PI), das die Identifizierung lebensfähige...

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Diskussion

Oocyte Kryokonservierung ist eine entscheidende Keimplasma-Konservierungstechnik, vor allem in Taxa, wo viele Arten gefährdet sind, wie Felidae Familie. In diesem Manuskript wurde ein einfaches und feldfreundliches Protokoll zur Verglasung unreifer Katzenoozyten vorgestellt. Labormittel, minimale Volumenverglasungsstützen und geschultes Personal sind die Schlüsselfaktoren für den Erfolg dieser Methode, die es ermöglicht, lebensfähige Eizellen konsequent und wiederholt zu erhalten, wie die repräsentativen Ergebniss...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 und von der Université degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Wir danken auch Dr. MariaGiorgia Morselli für ihren Beitrag zu den hierdargestellten Experimenten und zur Bildaufnahme.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BSigma-AldrichA2942/
Automatic pipettes & tips//Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL
Surgical scalpels//Size 10 is usually ok
Bunsen beak///
Clamps//Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen
CryotopKitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies)01.CRDistributors and catalog number may change in different countries
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650/
Ethylene glycol (EG)Sigma-AldrichE9129/
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-AldrichF9665/
Glass Pasteur pipettes//Advised lenght 230 mm (100+130)
Gobelets//According to the canisters of the storage tank
Heating stage//All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC
Liquid nitrogen///
Medium 199Sigma-AldrichM4530/
Phosphate-buffered saline (PBS)Sigma-AldrichD8662/
Penicillin G sodiumSigma-AldrichP3032/
Polyvinyl alcohol (PVA)Sigma-AldrichP8136/
Repro plateKitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies)01.K-2Distributors and catalog number may change in different countries
Stereomicroscope//As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok
Storage tank//Any regularly filled tank is ok
Streptomycin sulphateSigma-AldrichS9137/
Styrofoam/nitrogen resistant box//All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack"
SucroseSigma-AldrichS1888/
Timers//All timers which can be set on times until 9 minutes are ok

Referenzen

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