T- und B-Zell-Rezeptor-Immunrepertoireanalyse mittels Next-Generation-Sequencing

Zusammenfassung

Das aktuelle Protokoll beschreibt eine Methode zur DNA-Isolierung aus Blutproben und Darmbiopsien, die Generierung von TCRβ- und IGH-PCR-Bibliotheken für die Sequenzierung der nächsten Generation, die Durchführung eines NGS-Laufs und die grundlegende Datenanalyse.

Zusammenfassung

Das immunologische Gedächtnis, das Kennzeichen der adaptiven Immunität, wird durch T- und B-Lymphozyten orchestriert. Im Kreislauf und in verschiedenen Organen gibt es Milliarden von einzigartigen T- und B-Zellklonen, und jeder kann ein spezifisches Antigen binden, was zu Proliferation, Differenzierung und / oder Zytokinsekretion führt. Die enorme Heterogenität in T- und B-Zellen wird durch zufällige Rekombination verschiedener genetischer Segmente erzeugt. Next-Generation-Sequencing-Technologien (NGS), die in den letzten zehn Jahren entwickelt wurden, ermöglichen einen beispiellosen detaillierten Einblick in das Immunrepertoire der T- und B-Zellrezeptoren. Studien zu verschiedenen entzündlichen Erkrankungen, Immundefekten, Infektionen und Malignomen zeigten deutliche Veränderungen der Klonalität, der Gennutzung und der biophysikalischen Eigenschaften des Immunrepertoires und lieferten wichtige Erkenntnisse über die Rolle adaptiver Immunantworten bei verschiedenen Erkrankungen.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für NGS des Immunrepertoires von T- und B-Zellen aus Blut und Gewebe zur Verfügung. Wir präsentieren eine Pipeline, die von der DNA-Isolierung über die Bibliotheksvorbereitung, die Sequenzierung auf NGS-Sequenzierern bis hin zu grundlegenden Analysen beginnt. Diese Methode ermöglicht die Erforschung spezifischer T- und B-Zellen auf Nukleotid- oder Aminosäureebene und kann so dynamische Veränderungen in Lymphozytenpopulationen und Diversitätsparametern bei verschiedenen Erkrankungen identifizieren. Diese Technik kommt langsam in die klinische Praxis und hat das Potenzial für die Identifizierung neuartiger Biomarker, Risikostratifizierung und Präzisionsmedizin.

Einleitung

Das adaptive Immunsystem, bestehend aus T- und B-Lymphozyten, nutzt das immunologische Gedächtnis, um ein zuvor angetroffenes Antigen zu erkennen und eine schnelle Reaktion einzuleiten. Lymphozyten werden im Knochenmark erzeugt und reifen im Thymus (T-Zellen) oder Knochenmark (B-Zellen). Sowohl der T-Zell-Rezeptor (TCR) als auch der B-Zell-Rezeptor (BCR) weisen einzigartige Konfigurationen auf, die die Erkennung spezifischer Antigene ermöglichen. In der Homöostase zirkulieren T- und B-Zellen ständig und untersuchen die Billionen verschiedener Peptide, die auf Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert werden. Die TCR- oder BCR-Ligatur eines spezifischen Antigens mit h....

Protokoll

Diese Studie wurde vom institutionellen Prüfungsausschuss des Sheba Medical Center genehmigt und die schriftliche Zustimmung aller teilnehmenden Probanden wurde eingeholt.

1. DNA-Isolierung und Quantifizierung

1. Verdauung und Zelllyse von Darmbiopsien
   1. Rufen Sie Darmbiopsien ab, die entweder frisch gesammelt oder bei -20 °C oder -80 °C gelagert werden. Wenn Sie gefrorene Biopsien verwenden, tauen Sie auf Eis auf.
   2. 600 μL Kernlyselösung in ein steriles 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben, das auf Eis gekühlt wird.
   3. Die Biopsie in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit Lyselösung geben und bei 65 °C für 15-30 m....

Ergebnisse

Hier beschreiben wir eine Methode zur DNA-Isolierung aus Darmgewebe und Blut, die Vorbereitung von Bibliotheken für NGS und grundlegende Schritte eines Sequenzierungslaufs zur Immunrepertoire-Sequenzierung. Der Lauf generiert fastq-Dateien, die weiter in fasta-Dateien für die Verwendung in der internationalen ImMunoGeneTics (IMGT) / HighV-QUEST-Plattform konvertiert werden können. Dieses HTS führt viele Analysen von Zehntausenden von neu angeordneten TCRβ- und IGH-Sequenzen auf der Nukleotidebene^15.......

Diskussion

Veränderungen in Der Häufigkeit und Funktion von B- und T-Lymphozyten treten häufig bei verschiedenen Malignomen^{auf 18}, chronisch entzündlichen Erkrankungen (z. B. Colitis ulcerosa und rheumatoide Arthritis)^10,19und in verschiedenen Immundefekten^17,20. Die aktuelle Methode nutzt NGS, um einen detaillierten Überblick über TCR- und BCR-Repertoires zu ermöglichen, was den Nachw.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-propanol	Sigma	I9516-500ML
1.7 mL micro-centrifuge tubes	Axygen	8187631104051
15 mL centrifuge tubes	Greiner	188261
Absolute ethanol	Merck	1.08543.0250
Amplitaq Gold	Thermo Fisher	N8080241
AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63881
Heat block	Bioer	Not applicable
High Sensitivity D1000 Sample Buffer	Agilent	5067-5603	For Tapestation
High Sensitivity D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5584	For Tapestation. Tubes sold seperately
Lymphotrack Assay kit	Invivoscribe	TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019	Each includes 24 indexes
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)	Illumina	MS-102-2003	Includes standard flow cell type and all reagents required
MiSeq Sequencer	Illumina	SY-410-1003
PCR strips	4titude	4ti-0792
Proteinase K	Invitrogen	EO0491
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher	Q33226
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32854	Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes
Shaker	Biosan	Not applicable
Tapestation 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2940CA
ultra pure water	Bio-lab	7501
Wizard DNA isolation kit	Promega	A1120	Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer