Reinigung von Tubulin mit kontrollierten posttranslationalen Modifikationen und Isotypen aus begrenzten Quellen durch Polymerisations-Depolymerisationszyklen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Tubulinreinigung aus kleinen/mittleren Quellen wie kultivierten Zellen oder Gehirnen mit einer Maus unter Verwendung von Polymerisations- und Depolymerisationszyklen. Das gereinigte Tubulin ist in bestimmten Isotypen angereichert oder hat spezifische posttranslationale Modifikationen und kann in In-vitro-Rekonstitutions-Assays zur Untersuchung der Mikrotubuli-Dynamik und -Wechselwirkungen verwendet werden.

Zusammenfassung

Ein wichtiger Aspekt der Untersuchungen des Mikrotubuli-Zytoskeletts ist die Untersuchung des Mikrotubuli-Verhaltens in In-vitro-Rekonstitutionsexperimenten. Sie ermöglichen die Analyse der intrinsischen Eigenschaften von Mikrotubuli, wie dynamik, und ihrer Wechselwirkungen mit mikrotubuli-assoziierten Proteinen (MAPs). Der "Tubulin-Code" ist ein neu entstehendes Konzept, das auf verschiedene Tubulin-Isotypen und verschiedene posttranslationale Modifikationen (PTMs) als Regulatoren von Mikrotubuli-Eigenschaften und -Funktionen verweist. Um die molekularen Mechanismen des Tubulin-Codes zu erforschen, ist es entscheidend, In-vitro-Rekonstitutionsexperimente mit gereinigtem Tubulin mit spezifischen Isotypen und PTMs durchzuführen.

Bis heute war dies technisch eine Herausforderung als Gehirn Tubulin, das weit verbreitet in In-vitro-Experimente verwendet wird, beherbergt viele PTMs und hat eine definierte Isotypzusammensetzung. Daher haben wir dieses Protokoll entwickelt, um Tubulin aus verschiedenen Quellen und mit unterschiedlichen Isotypzusammensetzungen und kontrollierten PTMs zu reinigen, wobei der klassische Ansatz von Polymerisations- und Depolymerisationszyklen verwendet wird. Im Vergleich zu bestehenden Methoden, die auf der Affinitätsreinigung basieren, ergibt dieser Ansatz reines, polymerisationskompetentes Tubulin, da Tubulin, das gegen Polymerisation oder Depolymerisation resistent ist, während der aufeinanderfolgenden Reinigungsschritte verworfen wird.

Wir beschreiben die Reinigung von Tubulin aus Zelllinien, die entweder in Suspension oder als anhantibe Kulturen angebaut werden, und von einzelnen Mausgehirnen. Das Verfahren beschreibt zunächst die Erzeugung von Zellmasse sowohl in Suspensions- als auch in Hafteinstellungen, dem Lyseschritt, gefolgt von den aufeinanderfolgenden Stadien der Tubulinreinigung durch Polymerisations-Depolymerisationszyklen. Unsere Methode liefert Tubulin, das in Experimenten verwendet werden kann, die sich mit dem Einfluss des Tubulin-Codes auf die intrinsischen Eigenschaften von Mikrotubuli und Mikrotubuli-Wechselwirkungen mit assoziierten Proteinen befassen.

Einleitung

Mikrotubuli spielen in vielen zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle. Sie geben Zellen ihre Form, bauen meiotische und mitotische Spindeln für die Chromosomensegregation und dienen als Spuren für den intrazellulären Transport. Um diese vielfältigen Funktionen auszuführen, organisieren sich Mikrotubuli auf unterschiedliche Weise. Eine der faszinierendsten Fragen auf diesem Gebiet ist es, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die es den strukturell und evolutionär konservierten Mikrotubuli ermöglichen, sich an diese Fülle von Organisationen und Funktionen anzupassen. Ein potenzieller Mechanismus ist die Diversifizierung der Mikrotubuli, die durch das Konzept ....

Protokoll

Die Tierpflege und -verwendung für diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Europäischen Gemeinschaft (2010/63/UE) durchgeführt. Experimentelle Verfahren wurden von der Ethikkommission des Institut Curie CEEA-IC #118 (Genehmigungnr. 04395.03 von der nationalen Behörde) in Übereinstimmung mit den internationalen Richtlinien ausdrücklich genehmigt.

1. Herstellung von Reagenzien zur Tubulinreinigung

HINWEIS: Alle Puffer, die für die Tubulinreinigung verwendet werden, sollten Kaliumsalze und NICHT Natriumsalze^{enthalten 30}.

1. Bereiten Sie 1 L des kompletten Mediums....

Ergebnisse

Das Hauptziel dieser Methode ist die Herstellung von hochwertigem, montagekompetentem Tubulin in Mengen, die für wiederholte In-vitro-Experimente mit den gereinigten Komponenten ausreichen. Aus diesem Tubulin zusammengesetzte Mikrotubuli können in Rekonstitutionstests verwendet werden, die auf der gesamten internen Reflexionsfluoreszenz-Mikroskopie (TIRF) mit dynamischen oder stabilen Mikrotubuli basieren, in Experimenten, die Mikrotubulidynamik, Wechselwirkungen mit MAPs oder molekularen Motoren und die Krafterzeugung.......

Diskussion

Die hier beschriebene Methode bietet eine Plattform, um schnell hochwertiges, montagekompetentes Tubulin in mittelgroßen Mengen aus Zelllinien und einzelnen Mausgehirnen zu erzeugen. Es basiert auf dem Gold-Standard-Protokoll der Tubulinreinigung von Rinderhirnen, die seit vielen Jahren im Feld verwendet werden^16,17. Ein besonderer Vorteil des Ansatzes ist die Verwendung von Suspensionskulturen von HeLa S3-Zellen, die, sobald sie etabliert sind, große Mengen an.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M MgCl2	Sigma	#M1028
1-L cell culture vessels	Techne F7610		Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells.
1.5- and 2-ml tubes
14-ml round-bottom tubes
15-cm-diameter sterile culture dishes
15-ml screw-cap tubes
2-mercaptoethanol	Sigma	#M3148	2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood.
4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride	Sigma	#A8456
40% Acrylamide	Bio-Rad	#161-0140
5-, 10- 20-ml syringes
5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes
50-ml screw-cap tubes
Ammonium persulfate (APS)	Sigma	#A3678
Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10	Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa		dilution: 1/500
Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335	AdipoGen	#AG-20B-0020	dilution: 1/20,000
Aprotinin	Sigma	#A1153
Balance (0.1 – 10 g)
Beckman 1-l polypropylene bottles			For collecting spinner cultures
Beckman Avanti J-26 XP centrifuge			For collecting spinner cultures
Biological stirrer	Techne MCS-104L		Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells
Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide	Bio-Rad	#161-0201
Blender IKA Ultra-Turrax®			For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	#A7906
Bromophenol blue	Sigma	#1.08122
Carboxypeptidase A (CPA)	Sigma	#C9268	Concentration: 1.7 U/µl
Cell culture hood
Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	#D8418	DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection.
DMEM medium	Life Technologies	#41965062
DTT, DL-Dithiothreitol	Sigma	#D9779
EDTA	Euromedex	#EU0007-C
EGTA	Sigma	#E3889
Ethanol absolute	Fisher Chemical	#E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	#F7524
French pressure cell press	Thermo electron corporation	#FA-078A	with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber).
Glycerol	VWR Chemicals	#24388.295
Glycine	Sigma	#G8898
GTP	Sigma	#G8877
Heating block	Stuart	#SBH130D
Hela cells		ATCC® CCL-2™
Hela S3 cells	ATCC	ATCC® CCL-2.2™
Hydrochloric acid (HCl )	VWR	#20252.290
Inverted microscope			With fluorescence if cell transfection is to be verified
Isopropanol	VWR	#20842.298
jetPEI	Polyplus	#101
JLA-8.1000 rotor			For collecting spinner cultures
KOH	Sigma	#P1767	KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection.
L-Glutamine	Life Technologies	#25030123
Laboratory centrifuge for 50-ml tubes	Sigma	4-16 K
Leupeptin	Sigma	#L2884
Liquid nitrogen
Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips
Micropestles	Eppendorf	#0030 120.973
Mouse brain tissue			Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines.
Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm	Terumo	#18G
Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm	Terumo	#20G
Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm	B.Braun	#466 5643
Parafilm
PBS	Life Technologies	#14190169
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	#15140130
pH-meter
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	#P7626	PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions.
PIPES	Sigma	#P6757
Pipette-boy
Rotors	Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55
SDS-PAGE electrophoresis equipment	Bio-Rad	#1658001FC
SDS, Sodium dodecyl sulphate	VWR	#442444H	For preparing Laemmeli buffer
SDS, Sodium dodecyl sulphate	Sigma	#L5750	For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels
Sonicator	Branson	#101-148-070	Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used.
Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes	Eppendorf	5417R
TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine	Sigma	#9281
Trichostatin A (TSA)	Sigma	#T8552
Triton X-100	Sigma	#T9284
Trizma base (Tris)	Sigma	#T1503
Trypsin	Life Technologies	#15090046
Ultracentrifuge rotors		TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors	Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment
Ultracentrifuge tubes	Beckman	#357448	for using with TLA-55 rotor
Ultracentrifuge tubes	Beckman	#349622	for using with TLA-100.3 rotor
Ultracentrifuge tubes	Beckman	#355631	for using with 70.1 Ti rotor
Ultracentrifuges	Beckman	Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent)	Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment
Vortex mixer
Water bath equipped with floaters or tube holders			Set at 30°C