Zellfreie Produktion von Proteoliposomen für die funktionelle Analyse und Antikörperentwicklung gegen Membranproteine

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes zellfreies Verfahren zur Herstellung von hochwertigem Proteoliposom mittels Doppelschichtdialysemethode unter Verwendung eines weizenzellenfreien Systems und Liposomen. Diese Methode bietet geeignete Mittel für die funktionelle Analyse von Membranproteinen, das Screening von Wirkstoffzielen und die Entwicklung von Antikörpern.

Zusammenfassung

Membranproteine spielen eine wesentliche Rolle in einer Vielzahl von zellulären Prozessen und erfüllen lebenswichtige Funktionen. Membranproteine sind in der Wirkstoffforschung von medizinischer Bedeutung, da sie das Ziel von mehr als der Hälfte aller Medikamente sind. Ein Hindernis für die Durchführung biochemischer, biophysikalischer und struktureller Studien von Membranproteinen sowie für die Antikörperentwicklung war die Schwierigkeit, große Mengen an hochwertigem Membranprotein mit korrekter Konformation und Aktivität herzustellen. Hier beschreiben wir eine "Bilayer-Dialysemethode" mit einem weizenkeimzellfreien System, Liposomen und Dialysebechern, um Membranproteine effizient zu synthetisieren und gereinigte Proteoliposomen in kurzer Zeit mit einer hohen Erfolgsrate herzustellen. Membranproteine können ebenso hergestellt werden wie in mehreren Milligramm, wie GPCRs, Ionenkanälen, Transportern und Tetraspaninen. Diese zellfreie Methode trägt dazu bei, Zeit, Kosten und Aufwand für die Herstellung hochwertiger Proteoliposomen zu reduzieren und bietet geeignete Mittel für die funktionelle Analyse von Membranproteinen, das Screening von Wirkstoffzielen und die Antikörperentwicklung.

Einleitung

Membranproteine sind eines der wichtigsten Wirkstoffziele in Diagnose und Therapie. Tatsächlich sind die Hälfte der kleinen Wirkstoffe Membranproteine wie G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) und Ionenkanäle¹. Im Laufe der Jahre haben Forscher an biochemischen, biophysikalischen und strukturellen Studien von Membranproteinen gearbeitet, um ihre Struktur und Funktion aufzuklären ^2,3. Die Entwicklung monoklonaler Antikörper gegen Membranproteine wird ebenfalls aktiv durchgeführt, um funktionelle und strukturelle Studien zu beschleunigen und therapeutische und diagnostische Anwendungen ....

Protokoll

1. Herstellung von pEU-Expressionsplasmid

HINWEIS: Das pEU-Expressionsplasmid sollte Startcodon, offenen Leserahmen des Zielmembranproteins und Stopcodon im Fragment enthalten (siehe Abbildung 1). Fügen Sie bei Bedarf Erkennungs-/Reinigungs-Tag-Sequenz(en) an der entsprechenden Position hinzu. Für das Subklonen ist entweder die Restriktionsenzymverdauung oder das nahtlose Klonen anwendbar. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das eine nahtlose Klonmethode verwendet.

1. Bereiten Sie das DNA-Fragment vor.
   1. Amplifizieren Sie das interessierende Gen durch PCR unter Verwendung der cDNA-Vorlage, Primer 1 ....

Ergebnisse

Mit diesem Protokoll können teilweise gereinigte Proteoliposomen in kurzer Zeit erhalten werden. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 2A dargestellt. Fünfundzwanzig GPCRs der Klassen A, B und C wurden erfolgreich mit der Doppelschichtdialysemethode (kleiner Maßstab) synthetisiert und teilweise durch Zentrifugation und Pufferwäsche gereinigt. Obwohl die Menge der synthetisierten Proteine je nach Proteintyp variiert, können bei Verwendung großer Dialysebecher in der Regel 50 bis .......

Diskussion

Das vorgestellte Protokoll bietet eine Methode zur Herstellung von Membranproteinen mit einer hohen Erfolgsrate. Dieses Protokoll ist einfach, hochgradig reproduzierbar und leicht zu skalieren. Es hat auch das Potenzial, den Zeit- und Kostenaufwand für Experimente zu reduzieren, die eine große Menge an Membranproteinen verbrauchen. Die Zweischichtdialysemethode verbessert die Produktivität um das 4- bis 10-fache im Vergleich zur Doppelschichtmethode oder Dialysemethode (Abbildung 2B)

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
×3 SDS-PAGE sample buffer			Containing 10% 2-mercaptoethanol
5-20% gradient SDS-PAGE gel	ATTO	E-D520L
70% ethanol			Diluted ethanol by ultrapure water.
Agarose	Takara Bio
Ammonium acetate	Nakalai tesque	02406-95	As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30°C.
Ampicillin Sodium	Nakalai tesque	02739-74
Asolectin Liposome, lyophilized	CellFree Sciences	CFS-PLE-ASL	A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.
BSA standard			1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 µL ×1 SDS-PAGE sample buffer
CBB gel stain
cDNA clone of interest			Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment
Chloroform	Nakalai tesque	08402-84
Cooled incubator			Temperature ranging from 0 to 40 °C or wider.
Creatine kinase	Roche Diagnostics	04524977190
Dialysis cup (0.1 mL)	Thermo Fisher Scientific	69570	Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL
Dialysis cup (2 mL)	Thermo Fisher Scientific	88404	Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL
DNA ladder marker	Thermo Fisher Scientific	SM0311	GeneRuler 1 kb DNA Ladder
DpnI	Thermo Fisher Scientific	FD1703	FastDigest DpnI
E. coli strain JM109
Electrophoresis chamber	ATTO
Ethanol (99.5%)	Nakalai tesque	14713-95
Ethidium bromide
Evaporation flask, 100 mL
Gel imager
Gel scanner			We use document scanner and LED immuninator as a substitute.
LB broth
Lipids of interest	Avanti Polar Lipids
Micro centrifuge	TOMY	MX-307
NTP mix	CellFree Sciences	CFS-TSC-NTP	Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each
Nuclease-free 25 mL tube	IWAKI	362-025-MYP
Nucrease-free plastic tubes	Watson bio labs		Do not autoclave. Use them separately from other experiments.
Nucrease-free tips	Watson bio labs		Do not autoclave. Use them separately from other experiments.
PBS buffer
PCR purification kit	MACHEREY-NAGEL	740609	NucleoSpin Gel and PCR Clean-up
pEU-E01-MCS vector	CellFree Sciences	CFS-11
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)	Nippon Gene	311-90151
Plasmid prep Midi kit	MACHEREY-NAGEL	740410	NucleoBond Xtra Midi
Primer 1	Thermo Fisher Scientific	Custom oligo synthesis	5’-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’ Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 2	Thermo Fisher Scientific	Custom oligo synthesis	5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’ Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 3	Thermo Fisher Scientific	Custom oligo synthesis	5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3' Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 4	Thermo Fisher Scientific	Custom oligo synthesis	5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3' Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 5	Thermo Fisher Scientific	Custom oligo synthesis	5’-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3’ Sequencing primer, forward
Primer 6	Thermo Fisher Scientific	Custom oligo synthesis	5’- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3’ Sequencing primer, reverse
Protein size marker	Bio-Rad	1610394	Precision Plus Protein Standard
Rotary evaporator
seamless cloning enzyme mixture	New England BioLabs	E2611L	Gibson Assembly Master Mix Other seamless cloning reagents are also avairable.
SP6 RNA Polymerase & RNase Inhibitor	CellFree Sciences	CFS-TSC-ENZ
Submarine Electrophoresis system
TAE buffer
Transcription Buffer LM	CellFree Sciences	CFS-TSC-5TB-LM
Translation buffer	CellFree Sciences	CFS-SUB-SGC	SUB-AMIX SGC (×40) stock solution (S1, S2, S3, S4). Prepare ×1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.
Ultrapure water			We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave. We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system. Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.
Ultrasonic homogenizer	Branson	SONIFIER model 450D-Advanced	Ultrasonic cleaner can be used as a substitute.
UV transilluminator
Vacuum desiccator
Wheat germ extract	CellFree Sciences	CFS-WGE-7240	WEPRO7240