Elektroporationsbasierte genetische Veränderung von primären menschlichen Pigmentepithelzellen mit dem Dornröschen-Transposon-System

Zusammenfassung

Wir haben ein Protokoll entwickelt, um primäre menschliche Pigmentepithelzellen durch Elektroporation mit dem Gen, das für den Pigmentepithel-abgeleiteten Faktor (PEDF) kodiert, unter Verwendung des Sleeping Beauty (SB) Transposon-Systems zu transfizieren. Die erfolgreiche Transfektion wurde durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), Immunoblotting und enzymgebundenen Immunassay (ELISA) nachgewiesen.

Zusammenfassung

Unsere zunehmend alternde Gesellschaft führt zu einer zunehmenden Inzidenz neurodegenerativer Erkrankungen. Bisher sind die pathologischen Mechanismen nur unzureichend verstanden, was die Etablierung definierter Therapien erschwert. Zellbasierte additive Gentherapien zur erhöhten Expression eines Schutzfaktors gelten als vielversprechende Option zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen wie der altersbedingten Makuladegeneration (AMD). Wir haben eine Methode zur stabilen Expression des Gens entwickelt, das für den Pigmentepithel-abgeleiteten Faktor (PEDF) kodiert, der als neuroprotektives und antiangiogenes Protein im Nervensystem charakterisiert wird, in das Genom primärer humaner Pigmentepithelzellen (PE) unter Verwendung des Dornröschen-Transposon-Systems. Primäre PE-Zellen wurden aus menschlichen Spenderaugen isoliert und in Kultur gehalten. Nach Erreichen des Zusammenflusses wurden 1 x 10⁴ Zellen in 11 μL Resuspensionspuffer suspendiert und mit 2 μL einer gereinigten Lösung kombiniert, die 30 ng hyperaktives SB (SB100X) Transposase-Plasmid und 470 ng PEDF-Transposon-Plasmid enthielt. Die genetische Veränderung erfolgte mit einem Kapillarelektroporationssystem unter Verwendung folgender Parameter: zwei Impulse mit einer Spannung von 1.100 V und einer Breite von 20 ms. Transfizierte Zellen wurden in Kulturplatten überführt, die ein mit fetalem Rinderserum ergänztes Medium enthielten; Antibiotika und Antimykotika wurden mit dem ersten Medienaustausch hinzugefügt. Die erfolgreiche Transfektion wurde in unabhängig durchgeführten Experimenten nachgewiesen. Die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) zeigte die erhöhte Expression des PEDF-Transgens. Die PEDF-Sekretion war signifikant erhöht und blieb stabil, wie durch Immunoblotting bewertet und durch Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) quantifiziert. Der SB100X-vermittelte Transfer ermöglichte eine stabile PEDF-Genintegration in das Genom von PE-Zellen und stellte die kontinuierliche Sekretion von PEDF sicher, was für die Entwicklung einer zellbasierten Genadditionstherapie zur Behandlung von AMD oder anderen degenerativen Netzhauterkrankungen entscheidend ist. Darüber hinaus zeigte die Analyse des Integrationsprofils des PEDF-Transposons in menschliche PE-Zellen eine fast zufällige genomische Verteilung.

Einleitung

Das fortgeschrittene Alter wird als Hauptrisiko für neurodegenerative Erkrankungen beschrieben. Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD), eine polygene Erkrankung, die bei Patienten über 60 Jahren zu schwerem Sehverlust führt, gehört zu den vier häufigsten Ursachen für Erblindung und Sehbehinderung¹ und wird voraussichtlich bis 2040 auf 288 Millionen Menschen ansteigen². Funktionsstörungen des retinalen Pigmentepithels (RPE), einer einzigen Schicht dicht gepackter Zellen zwischen der Choriokapillare und den retinalen Photorezeptoren, tragen zur Pathogenese der AMD bei. Das RPE erfüllt mehrere Aufgaben, die für eine no....

Protokoll

Humane Spenderaugen wurden von der Aachener Hornhautbank der Augenklinik (Universitätsklinikum RWTH Aachen) nach Einholung der Einverständniserklärung gemäß den Protokollen der Deklaration von Helsinki bezogen. Die Verfahren für die Entnahme und Verwendung von Humanproben wurden von der institutionellen Ethikkommission genehmigt.

1. Isolierung primärer humaner RPE-Zellen

1. Legen Sie sterile Schutzkleidung und Handschuhe aus. Legen Sie einen sterilen Vorhang unter eine laminare Strömung.
2. Legen Sie sterile Präparationsinstrumente und andere notwendige sterile Geräte unter die laminare Strömung.
3. Notieren Sie den Erh....

Ergebnisse

Kultivierung und Elektroporation primärer humaner RPE-Zellen
Wir haben gezeigt, dass die Aussaat einer ausreichenden Anzahl von primären RPE-Zellen tierischen Ursprungs die Kultivierung und das Wachstum zu einer integrierten Monoschicht pigmentierter, hexagonal geformter Zellen^{ermöglicht 36,37,48}. Ihre Fähigkeit, Tight Junctions zu bilden, phagozytische Aktivität zu zeige.......

Diskussion

In unserem Projekt streben wir die nicht-virale Produktion von gentechnisch veränderten primären humanen RPE-Zellen an, die kontinuierlich einen wirksamen Faktor überexprimieren und sezernieren, um die transfizierten Zellen als Langzeittherapeutikum für die Etablierung und Aufrechterhaltung einer schützenden Umgebung zu nutzen. Wir haben die Einführung des Gens etabliert, das für PEDF kodiert, ein ubiquitär exprimiertes multifunktionales Protein mit antiangiogenen und neuroprotektiven Funktionen. Das hier beschri.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation of primary human RPE cells
24-Well Cell Culture Plate	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Colibri Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18950
Curved Iris Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18856
Disposable Scalpel (No. 11)	Feather, Osaka, Japan
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Extra Fine Pointed Eye Scissor	Geuder, Heidelberg, Germany	G-19405
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Glass Pasteur Pipettes	Brand, Wertheim, Germany	747715
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Sterile Drape	Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany
Sterile Gauze Compress	Fink-Walter, Merchweiler, Germany	321063
Sterile Gloves	Sempermed, Wien, Austria
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)	Corning, Corning, NY	351007
Sterile Surgical Gown	Halyard Health, Alpharetta, GA
Straight Iris Forceps	Geuder, Heidelberg, Germany	G-18855
Electroporation of primary human RPE cells
10 mM Tris-HCl (pH 8.5)
12-Well Cell Culture Plate	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	150628
24-Well Cell Culture Plate	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Inverted Microscope	Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany	Leica DMi8
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Capillary Transfection System (Neon Transfection System)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK1096
Hemocytometer (Neubauer Chamber)	Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	0640110
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+	Biochrom, Berlin, Germany	L182-50
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (10 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Plasmid Maxi Kit	Qiagen, Hilden, Germany	12163
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Trypan Blue Solution	Merck, Darmstadt, Germany	T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054
Analyses of transfected primary human RPE cells
10% SDS-Polyacrylamide Gel
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)
2x SDS Sample Buffer
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane	Cytiva, Marlborough, MA	10600015
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germany	A2942
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)	BioProducts, Middletown, MD	AB-PEDF1
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)	Qiagen, Hilden, Germany	34660
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P04-41150
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germany	P40-37500
Hemocytometer (Neubauer Chamber)	Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	0640110
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)	Agilent Dako, Santa Clara, CA	P0260
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab6721
Human PEDF ELISA Kit	BioProducts, Middletown, MD	PED613
LAS-3000 Imaging System	Fujifilm, Minato, Japan
LightCycler 1.2 Instrument	Roche Life Science, Penzberg, Germany
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I	Roche Life Science, Penzberg, Germany	12239264001
LightCycler Capillaries (20 μl)	Roche Life Science, Penzberg, Germany	4929292001
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1658015
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1658004
Ni-NTA Superflow	Qiagen, Hilden, Germany	30410
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	26616
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germany	P0781
Pipette Tips (10 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL)	Starlab, Hamburg, Germany
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1645050
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	51304
Reverse Transcription System	Promega, Madison, WI	A3500
RNase-Free DNase Set	Qiagen, Hilden, Germany	79254
RNeasy Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Rocking Shaker	Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom	SSM3
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (0.1-10 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL)	Eppendorf, Hamburg, Germany
Trans-Blot Turbo Transfer System	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany	1704150
Trypan Blue Solution	Merck, Darmstadt, Germany	T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054