High-Content-Screening-Differenzierungs- und Reifungsanalyse von fetalen und adulten neuralen Stammzellen-abgeleiteten Oligodendrozyten-Vorläuferzellkulturen

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Produktion von Mischkulturen von Astrozyten und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, die aus fetalen oder adulten neuralen Stammzellen gewonnen werden, die sich in reife Oligodendrozyten unterscheiden, und in vitro die Modellierung schädlicher Reize. Die Kopplung mit einer zellbasierten High-Content-Screening-Technik bildet ein zuverlässiges und robustes Wirkstoff-Screening-System.

Zusammenfassung

Die Haupthürde bei der Entwicklung von Arzneimittel-Screening-Techniken zur Beurteilung der Wirksamkeit therapeutischer Strategien bei komplexen Krankheiten besteht darin, ein Gleichgewicht zwischen in vitro Vereinfachung und der Wiederherstellung der komplexen In-vivo-Umgebung zu finden, zusammen mit dem Hauptziel, das von allen Screening-Strategien geteilt wird, robuste und zuverlässige Daten zu erhalten, die für die In-vivo-Translation hochprädiktiv sind.

Im Bereich der demyelinisierenden Erkrankungen basiert die Mehrheit der Arzneimittel-Screening-Strategien auf immortalisierten Zelllinien oder reinen Kulturen isolierter primärer Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) von neugeborenen Tieren, was zu starken Verzerrungen aufgrund des Fehlens altersbedingter Unterschiede und eines realen pathologischen Zustands oder einer realen pathologischen Komplexität führt.

Hier zeigen wir den Aufbau eines In-vitro-Systems, das darauf abzielt, die physiologische Differenzierung / Reifung von aus neuronalen Stammzellen (NSC) abgeleiteten OPCs zu modellieren, die leicht manipuliert werden können, um pathologische Zustände nachzuahmen, die für demyelinisierende Krankheiten typisch sind. Darüber hinaus beinhaltet die Methode die Isolierung von fetalen und erwachsenen Gehirnen, wodurch ein System entsteht, das sich dynamisch von OPCs zu reifen Oligodendrozyten (OLs) in einer spontanen Kokultur unterscheidet, die auch Astrozyten umfasst. Dieses Modell ähnelt physiologisch dem Schilddrüsenhormon-vermittelten Myelinisierungs- und Myelinreparaturprozess, was die Zugabe von pathologischen Interferenzen ermöglicht, die Krankheitsmechanismen modellieren. Wir zeigen, wie man die beiden Hauptkomponenten demyelinisierender Erkrankungen (d.h. Hypoxie/Ischämie und Entzündung) nachahmen kann, indem man ihre Wirkung auf die Entwicklungsmyelinisierung und die adulte Myelinreparatur nachbildet und alle Zellkomponenten des Systems durchgehend berücksichtigt, während wir uns auf die Differenzierung von OPCs konzentrieren.

Dieses spontane Mischmodell, gekoppelt mit zellbasierten High-Content-Screening-Technologien, ermöglicht die Entwicklung eines robusten und zuverlässigen Wirkstoff-Screening-Systems für therapeutische Strategien, die darauf abzielen, die pathologischen Prozesse der Demyelinisierung zu bekämpfen und die Remyelinisierung zu induzieren.

Einleitung

Im zentralen Nervensystem (ZNS) sind myelinbildende Zellen (Oligodendrozyten, OLs) und ihre Vorläufer (Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, OPCs) für die Entwicklungsmyelinisierung, ein Prozess, der während der peri- und postnatalen Periode auftritt, sowie für den Myelinumsatz und die Myelinreparatur (Remyelinisierung) im Erwachsenenalter verantwortlich¹. Diese Zellen sind hochspezialisiert und interagieren anatomisch und funktionell mit allen anderen glialen und neuronalen Komponenten, was sie zu einem grundlegenden Bestandteil der Struktur und Funktion des ZNS macht.

Demyelinisierende Ereignisse sind an verschiedenen ....

Protokoll

Alle hier beschriebenen Tierprotokolle wurden gemäß den Richtlinien des Rates der Europäischen Gemeinschaft (86/609/EWG) durchgeführt und entsprechen den im NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren veröffentlichtenRichtlinien.

1. Lösungen und Reagenzien

1. Standardmedium vorbereiten: DMEM/F12 GlutaMAX 1x; 8 mmol/L HEPES; 100 U/100 μg Penicillin/Streptomycin (1% p/s); 1x B27; 1x N-2.
2. Neurosphärenmedium vorbereiten: 10 ng/ml bFGF hinzufügen; 10 ng/mL EGF auf Standardmedium.
3. Oligosphäre/OPC-Medium vorbereiten: 10 ng/ml bFGF zugeben; 10 ng/mL PDGF-AA auf Standardmedium.
4. Oligode....

Ergebnisse

Die erste Phase der Kultur kann in der Dauer variieren, abhängig von der Aussaatdichte und davon, ob die Kugeln fetalen oder erwachsenen Ursprungs sind. Darüber hinaus zeigen Oligosphären eine reduzierte Populationsverdopplung im Vergleich zu Neurosphären (Abbildung 1B). Darüber hinaus ist die Produktion von Kugeln aus erwachsenem Gewebe langsamer und es kann 2-3 Wochen dauern, bis Oligosphären erzeugt werden, verglichen mit fötalen, die je nach Aussaatdichte 1-2 Wochen dauern können.......

Diskussion

Die Komplexität von Myelinisierungs-/Remyelinisierungsprozessen und demyelinisierenden Ereignissen macht die Entwicklung prädiktiver In-vitro-Systeme extrem herausfordernd. Die am weitesten verbreiteten In-vitro-Wirkstoff-Screening-Systeme sind meist menschliche Zelllinien oder primäre reine OL-Kulturen, wobei zunehmend komplexere Cokulturen oder organotypische Systeme verwendet werden¹⁵. Auch wenn solche Systeme mit High-Content-Technologien gekoppelt sind, bleiben reine OL-Kulturen die Method.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plates - untreated	NUNC	267313
B27 supplement (100x)	GIBCO	17504-044
basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	GIBCO	PHG0024
BSA	Sigma-Aldrich	A2153
Ciliary Neurotropic Factor (CNTF)	GIBCO	PHC7015
DMEM w/o glucose	GIBCO	A14430-01
DMEM/F12 GlutaMAX	GIBCO	31331-028
DNase	Sigma-Aldrich	D5025-150KU
EBSS	GIBCO	14155-048
Epidermal Growth Factor (EGF)	GIBCO	PHG6045
HBSS	GIBCO	14170-088
HEPES	GIBCO	15630-056
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3884
IFN-γ	Origene	TP721239
IL-17A	Origene	TP723199
IL-1β	Origene	TP723210
IL-6	Origene	TP723240
laminin	GIBCO	23017-051
N-acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A9165
N2 supplement (50x)	GIBCO	17502-048
Non-enzymatic dissociation buffer	GIBCO	13150-016
PBS	GIBCO	70011-036
Penicillin / Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA)	GIBCO	PHG0035
poly-D,L-ornitine	Sigma-Aldrich	P4957
TGF-β1	Origene	TP720760
TNF-α	Origene	TP723451
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2752-1G
Trypsin	Sigma-Aldrich	T1426