In-Nucleus Hi-C in Drosophila-Zellen

Zusammenfassung

Das Genom ist im Kernraum in verschiedene Strukturen organisiert, die durch Chromosomenkonformationserfassungstechnologien aufgedeckt werden können. Die In-Nucleus-Hi-C-Methode liefert eine genomweite Sammlung von Chromatin-Interaktionen in Drosophila-Zelllinien, die Kontaktkarten generiert, die mit Megabasenauflösung auf Restriktionsfragmentebene untersucht werden können.

Zusammenfassung

Das Genom ist in topologisch assoziierenden Domänen (TADs) organisiert, die durch Grenzen begrenzt sind, die Interaktionen zwischen Domänen isolieren. Bei Drosophila werden die Mechanismen, die der TAD-Bildung und den Grenzen zugrunde liegen, noch untersucht. Die anwendung der hier beschriebenen In-Nucleus Hi-C-Methode trug dazu bei, die Funktion von architektonischen Protein-Bindenden (AP)-Stellen an TAD-Grenzen zu analysieren, die das Notch-Gen isolieren. Genetische Veränderungen von Domänengrenzen, die zum Verlust von APs führen, führen zu TAD-Fusion, Transkriptionsfehlern und langfristigen topologischen Veränderungen. Diese Ergebnisse lieferten Beweise für den Beitrag genetischer Elemente zur Bildung von Domänengrenzen und zur Kontrolle der Genexpression bei Drosophila. Hier wurde die in-nucleus Hi-C-Methode ausführlich beschrieben, die wichtige Checkpoints liefert, um die Qualität des Experiments zusammen mit dem Protokoll zu beurteilen. Gezeigt werden auch die erforderliche Anzahl von Sequenzierungslesungen und validen Hi-C-Paaren zur Analyse genomischer Interaktionen auf verschiedenen genomischen Skalen. CrispR/Cas9-vermittelte genetische Editierung regulatorischer Elemente und hochauflösendes Profiling genomischer Interaktionen mit diesem In-Nucleus-Hi-C-Protokoll könnte eine leistungsstarke Kombination für die Untersuchung der strukturellen Funktion genetischer Elemente sein.

Einleitung

Bei Eukaryoten ist das Genom in Chromosomen unterteilt, die während der Interphase¹bestimmte Territorien im Kernraum einnehmen. Das Chromatin, das die Chromosomen bildet, kann in zwei Hauptzustände unterteilt werden: einen von zugänglichem Chromatin, das transkriptionell freizügig ist, und den anderen von kompaktem Chromatin, das transkriptionell repressiv ist. Diese Chromatinzustände trennen sich und vermischen sich selten im Kernraum und bilden zwei verschiedene Kompartimente im Kern². Auf der Sub-Megabase-Skala trennen Grenzen Domänen von hochfrequenten Chromatin-Wechselwirkungen, sogenannte TADs, die die Chromosomeno....

Protokoll

1. Fixierung

1. Beginnen Sie mit 10 Millionen Schneider's Line 2 plus (S2R+) Zellen, um 17,5 ml einer Zellsuspension in Schneider-Medium herzustellen, das 10% fetales Rinderserum (FBS) bei Raumtemperatur (RT) enthält.
2. Fügen Sie methanolfreies Formaldehyd hinzu, um eine Endkonzentration von 2% zu erhalten. Mischen und inkubieren Sie für 10 Minuten bei RT, wobei Sie darauf achten, jede Minute zu mischen.
   HINWEIS: Formaldehyd ist eine gefährliche Chemikalie. Befolgen Sie die entsprechenden Gesundheits- und Sicherheitsvorschriften und arbeiten Sie im Abzug.
3. Löschen Sie die Reaktion durch Zugabe von Glycin, um eine Endkonzentration von 0,125 M....

Ergebnisse

Im Folgenden werden die Ergebnisse eines erfolgreichen Hi-C-Protokolls beschrieben (siehe eine Zusammenfassung des Hi-C-Protokollworkflows in Abbildung 1A). Während des Hi-C-Experiments im Kern gibt es mehrere Kontrollpunkte für die Qualitätskontrolle. Probenal aliquots wurden vor (UD) und nach (D) dem Chromatinrestriktionsschritt sowie nach der Ligatur (L) gesammelt. Die Vernetzung wurde umgekehrt und die DNA wurde gereinigt und auf einem Agarosegel ausgeführt. Ein Abstrich von 200-1000.......

Diskussion

Die hier vorgestellte In-Nucleus-Hi-C-Methode hat eine detaillierte Untersuchung der Drosophila-Genomtopologie mit hoher Auflösung ermöglicht und einen Überblick über genomische Interaktionen auf verschiedenen genomischen Skalen ermöglicht, von Chromatinschleifen zwischen regulatorischen Elementen wie Promotoren und Enhancern bis hin zu TADs und der Identifizierung großer Kompartimente²⁵. Die gleiche Technologie wurde auch effizient auf Säugetiergewebe mit einigen Modifikationen angewendet<.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% (vol/vol) paraformaldehyde solution	Agar Scientific	R1026
Biotin-14-dATP	Invitrogen	CA1524-016
ClaI enzyme	NEB	R0197S
COVARIS Ultrasonicator	Covaris	LE220-M220
Cut Smart	NEB	B72002S
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x	Life Technologies	41965-039
Dynabeads MyOne Streptabidin C1	Invitrogen	65002
Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered	Sigma	F9665
Klenow Dna PolI large fragment	NEB	M0210L
Klenow exo(-)	NEB	M0210S
Ligation Buffer	NEB	B020S
MboI enzyme	NEB	R0147M
NP40-Igepal	SIGMA	CA-420	Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer
PE adapter 1.0	Illumina	5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3'
PE adapter 2.0	Illumina	5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3'
PE PCR primer 1.0	Illumina	5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3'
PE PCR primer 2.0	Illumina	5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3'
Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1	SIGMA	P2069
Primer 1 (known interaction, Figure 2A)	Sigma	5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'
Primer 2 (known interactions, Figure 2A)	Sigma	5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'
Protease inhibitor cocktail tablet	Roche	4693132001
Proteinase K	Roche	3115879001
Qubit	ThermoFisher	Q33327
RNAse	Roche	10109142001
SPRI Beads	Beckman	B23318
T4 DNA ligase	Invitrogen	15224-025
T4 DNA polymerase	NEB	M0203S
T4 polynucleotide kinase (PNK)	NEB	M0201L
TaqPhusion	NEB	M0530S	DNA polymerase
Triton X-100			Non-ionic surfactant for quenching of SDS