Co-Kultur von Glioblastom-Stammzellen auf gemusterten Neuronen zur Untersuchung von Migration und zellulären Interaktionen

Summary

Hier präsentieren wir einen einfach zu bedienenden Co-Kultur-Assay zur Analyse der Glioblastom-Migration (GBM) an gemusterten Neuronen. Wir entwickelten ein Makro in der FiJi-Software zur einfachen Quantifizierung der GBM-Zellmigration auf Neuronen und beobachteten, dass Neuronen die invasive Kapazität von GBM-Zellen modifizieren.

Abstract

Glioblastome (GBMs), maligne Gliome des Grades IV, sind aufgrund ihrer aggressiven Eigenschaften eine der tödlichsten Krebsarten beim Menschen. Trotz signifikanter Fortschritte in der Genetik dieser Tumoren ist nicht gut bekannt, wie GBM-Zellen in das gesunde Gehirnparenchym eindringen. Insbesondere wurde gezeigt, dass GBM-Zellen über verschiedene Wege in den peritumoralen Raum eindringen; Das Hauptinteresse dieses Papiers ist der Weg entlang von White Matter Tracts (WMTs). Die Wechselwirkungen von Tumorzellen mit den peritumoralen Nervenzellkomponenten sind nicht gut charakterisiert. Hierin wurde eine Methode beschrieben, die den Einfluss von Neuronen auf die GBM-Zellinvasion bewertet. Dieser Artikel stellt einen fortschrittlichen Co-Kultur-In-vitro-Assay vor, der die WMT-Invasion nachahmt, indem er die Migration von GBM-stammähnlichen Zellen auf Neuronen analysiert. Das Verhalten von GBM-Zellen in Gegenwart von Neuronen wird durch ein automatisiertes Tracking-Verfahren mit Open-Source- und Free-Access-Software überwacht. Diese Methode ist für viele Anwendungen nützlich, insbesondere für funktionelle und mechanistische Studien sowie für die Analyse der Auswirkungen pharmakologischer Wirkstoffe, die die GBM-Zellmigration auf Neuronen blockieren können.

Introduction

Primäre maligne Gliome, einschließlich GBMs, sind verheerende Tumore mit einer mittleren Überlebensrate von 12 bis 15 Monaten, die für GBM-Patienten berichtet werden. Die aktuelle Therapie beruht auf einer großen Tumormassenresektion und Chemotherapie in Verbindung mit einer Strahlentherapie, die die Überlebensrate nur um wenige Monate verlängert. Therapeutische Misserfolge sind eng mit einer schlechten Medikamentenabgabe über die Blut-Hirn-Schranke (BBB) und mit invasivem Wachstum in perivaskulären Räumen, Hirnhäuten und entlang der WMTs¹verbunden. Perivaskuläre Invasion, auch vaskuläre Co-Option genannt, ist ein gut untersuchter Prozess, und die molekularen Mechanismen beginnen aufgeklärt zu werden; Der Prozess der GBM-Zellinvasion entlang von WMTs ist jedoch nicht gut verstanden. Tumorzellen wandern entlang der Scherer-Sekundärstrukturen in das gesunde Gehirn². Tatsächlich beschrieb Hans-Joachim Scherer vor fast einem Jahrhundert die invasiven Wege des GBM, die heute als perineuronale Satellitose, perivaskuläre Satellitose, subpiale Ausbreitung und Invasion entlang des WMT bezeichnet werden (Abbildung 1A).

Einige Chemokine und ihre Rezeptoren, wie stromalzellabgeleiteter Faktor-1α (SDF1α) und C-X-C-Motiv-Chemokinrezeptor 4 (CXCR4), aber nicht vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), scheinen an der WMT-Invasion beteiligt zu sein³. In jüngerer Zeit hat sich gezeigt, dass eine transzelluläre NOTCH1-SOX2-Achse ein wichtiger Weg bei der WMT-Invasion von GBM-Zellen^{ist 4}. Die Autoren beschrieben, wie GBM-Stammzellen in das Gehirnparenchym an teilweise nicht myelinisierten Neuronen eindringen, was auf die Zerstörung von Myelinscheiden durch GBM-Zellen hindeutet. Ein Meilenstein wurde 2019 erreicht, als drei Artikel in der Zeitschrift Nature veröffentlicht wurden, die die Rolle der elektrischen Aktivität bei der Gliomentwicklung unterstreichen^5,6. Bahnbrechende Arbeiten von Monje und Mitarbeitern beleuchten die zentrale Rolle der elektrischen Aktivität bei der Sekretion von Neuroligin-3, das die Gliomentwicklung fördert.

Winkler und Mitarbeiter beschrieben Verbindungen zwischen GBM-Zellen (Mikroröhrchen), die in invasiven Schritten entscheidend sind, und in letzter Zeit Interaktionen zwischen GBM-Zellen und Neuronen über neu beschriebene Neurogliom-Synapsen. Diese Strukturen begünstigen die glutamaterge Stimulation von α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure (AMPA) -Rezeptoren an der GBM-Zellmembran, die die Tumorentwicklung und -invasion fördern. Die Invasion von Tumorzellen ist ein zentraler Prozess bei der Verbreitung von Metastasen oder entfernten sekundären Herden, wie sie bei GBM-Patienten beobachtet wird. Es wurde festgestellt, dass mehrere Faktoren bei der GBM-Invasion wichtig sind, wie Thrombospondin-1, ein transformierender Wachstumsfaktor beta (TGFβ-reguliertes matrizelluläres Protein oder der Chemokinrezeptor CXCR3)^7,8.

Hier wurde ein vereinfachtes biomimetisches Modell zur Untersuchung der GBM-Invasion beschrieben, bei dem Neuronen auf Spuren von Laminin gemustert und GBM-Zellen darauf gesät werden, als Einzelzellen oder als Sphäroide (Abbildung 1B). Die beiden experimentellen Einstellungen zielen darauf ab, die Invasion auf Neuronen zu rekapitulieren, die in GBM^9,10,11beobachtet wird. Solche Modelle wurden in der Vergangenheit als ausgerichtete Nanofaser-Biomaterialien (Core-Shell-Elektrospinning) entwickelt, die es ermöglichen, die Zellmigration durch Modulation mechanischer oder chemischer Eigenschaften zu untersuchen¹². Das in diesem Artikel beschriebene Co-Kulturmodell ermöglicht ein besseres Verständnis dafür, wie GBM-Zellen auf Neuronen entweichen, indem neue molekulare Wege definiert werden, die an diesem Prozess beteiligt sind.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

Die schriftliche Einwilligung aller Patienten (vom Haukeland Hospital, Bergen, Norwegen, gemäß den Vorschriften der örtlichen Ethikkommission) wurde eingeholt. Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommissionen für Human- und Tierforschung der Universität Bordeaux. Trächtige Ratten wurden in der Tiereinrichtung der Universität Bordeaux untergebracht und behandelt. Die Euthanasie einer E18-getrhypten trächtigen Ratte wurde unter Verwendung von CO₂durchgeführt. Alle Tierversuche wurden gemäß den institutionellen Richtlinien durchgeführt und von der lokalen Ethikkommission genehmigt. Alle kommerziellen Produkte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der gemusterten Dias

1. Substratvorbereitung für die Mikrostrukturierung
   1. Behandeln Sie 18 mm kreisförmige Glasabdeckungen durch Luft-/Plasmaaktivierung für 5 min. Legen Sie die Abdeckel in eine geschlossene Kammer mit 100 μL (3-Aminopropyl)triethoxysilan in einen Ausstecher für 1 h.
   2. Mit 100 mg/ml Poly(ethylenglykol)-Succinimidylvalerat (Molekulargewicht 5.000 (Peg-SVA)) in 10 mM Carbonatpuffer, pH-> 8, für 1 h inkubieren. Ausgiebig mit Reinstwasser abspülen und unter einer chemischen Haube trocknen.
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt kann die Probe bei 4 °C im Dunkeln zur weiteren Verwendung gelagert werden.
   3. Fügen Sie den Photoinitiator, 4-Benzoylbenzyl-trimethylammoniumchlorid (PLPP), bei 14,7 mg / ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hinzu.
      HINWEIS: Eine konzentrierte Form von PLPP, ein PLPP-Gel, kann ebenfalls verwendet werden. Dies führt zu einer kürzeren UV-Beleuchtungszeit (UV), die zum Abbau der PEG-Bürste erforderlich ist (100 mJ/mm^2).
2. Photoinitiator-Gelabscheidung
   1. Bereiten Sie eine Mischung aus 3 μL PLPP-Gel und 50 μL absolutem Ethanol vor, um sich in der Mitte des Objektträgers abzulagern. Legen Sie die Probe unter eine chemische Haube, bis das absolute Ethanol vollständig verdampft ist.
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt kann die Probe bei 4 °C im Dunkeln zur weiteren Verwendung gelagert werden.
3. Glasobjektträger-Mikrostrukturierung
   1. Montieren Sie den Abdeckr in einer Ludin-Kammer und legen Sie ihn auf die motorisierte Bühne eines Mikroskops, das mit einem Autofokussystem ausgestattet ist.
   2. Laden Sie Bilder, die den vorgesehenen Mikromustern entsprechen, in die Software. Wenden Sie diese Parameter an: Replikation 4 x 4 mal, Abstand von 200 μm, UV-Dosis von 1.000 mJ/mm². Spülen Sie nach der automatischen UV-Beleuchtungssequenz das PLPP mit mehreren PBS-Waschungen weg.
      HINWEIS: Wenn PLPP-Gel verwendet wurde, entfernen Sie es durch ausgedehnte Wäschen mit entionisiertem Wasser, trocknen Sie es in einem Strom von N₂und lagern Sie es bei 4 ° C.
   3. Mit Laminin (50 μg/ml in PBS) 30 min inkubieren. Ausgiebig mit PBS waschen.
      HINWEIS: Eine fluoreszierende Lösung aus gereinigtem grün fluoreszierendem Protein (GFP, 10 μg/ml in PBS) kann mit Laminin gemischt werden, um die Mikromuster durch Fluoreszenzmikroskopie zu visualisieren.

2. Vorbereitung von Neuronen und GBM-Zellen für die Co-Kultur

1. Kultur embryonaler Ratten-Hippocampus-Neuronen
   1. Sezieren Sie den Hippocampus embryonaler (E18) Ratten und übertragen Sie das Gewebe in eine Ausgewogene Salzlösung (HBSS) von Hank / 1 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) / Penicillin-Streptomycin-Lösung in einem 15-ml-Röhrchen. Entfernen Sie überschüssige Lösung, ohne den Hippocampus zu trocknen.
   2. 5 ml Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) mit Penicillin (10.000 Einheiten/ml)/Streptomycin (10.000 μg/ml) und 1 mM HEPES zunehmen und 15 min bei 37 °C inkubieren. Waschen Sie 2x mit der HBSS / HEPES / Penicillin-Streptomycin-Lösung und lassen Sie das Gewebe 2-3 min in dieser Lösung bleiben.
   3. Dissoziieren Sie das Gewebe mit zwei flammpolierten Pasteur-Pipetten, indem Sie mit jedem Gewebe 10x auf und ab pipettieren und dabei darauf achten, das Schäumen zu minimieren. Zählen Sie die Zellen und bewerten Sie die Lebensfähigkeit der Zellsuspension. Platten Sie die Neuronen auf mikrostrukturierten Coverlips, wie unten angegeben.
      HINWEIS: Die Zelllebensfähigkeitsrate beträgt 85-90% nach der Extraktion.
2. Zellkultur für Neuronen auf mikrostrukturierten Coverlips
   1. Rehydrieren Sie mikrostrukturierte Glasobjektträger mit PBS und inkubieren Sie das gesamte neuronale Zellkulturmedium.
   2. Säen Sie die hippokampalen Neuronen, die von E18 Sprague-Dawley-Ratten gewonnen werden, direkt über dem mikrostrukturierten Glasdeckel mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro^cm2 in neurobasalem Medium (NBM), angereichert mit 3% Pferdeserum. Legen Sie die mikrostrukturierten Neuronen für 48 h in den Inkubator (37 °C, 5% CO_2).
      HINWEIS: Nach ~ 6 h können primäre Hippocampus-Neuronen gesehen werden, die an den Laminin-Mikromustern haften.
3. Co-Kultur menschlicher GBM-Stammzellen auf Neuronen
   HINWEIS: Für diese Studie wurden Membran-GFP-positive und kerntomaten-patientenbasierte GBM-Zellen gemäß den zuvor veröffentlichten Protokollen¹⁰gezüchtet.
   1. Wenn die kugelförmigen Zellen in Suspension wachsen, zentrifugieren Sie die Suspension für 5 min bei 200 × g. Waschen Sie die Sphäroide mit 5 ml PBS und inkubieren Sie die Zellen mit 0,5 ml des Zelldissoziationsreagenzes (siehe Materialtabelle)für 5 min bei 37 °C.
   2. Fügen Sie 4,5 ml vollständiges NBM hinzu (ergänzt mit B27-Ergänzung, Heparin, Fibroblastenwachstumsfaktor 2, Penicillin und Streptomycin, wie zuvor beschrieben⁸), und zählen Sie die Zellen mit einer automatischen Zähltechnik.
   3. Säen Sie 1.000 GBM-Zellen über die mikrostrukturierte neuronale Kultur in NBM, angereichert mit 3% Pferdeserum. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C, 5% CO₂und 95% Luftfeuchtigkeit.

3. Bildgebung lebender Zellen

1. Unmittelbar nach der GBM-Zellaussaat legen Sie die Probe auf die Bühne eines invertierten Mikroskops, das mit einer Thermostatkammer ausgestattet ist. Führen Sie Live-Cell-Bildgebung auf dem Mikroskop durch, das mit einer motorisierten Bühne zur Aufzeichnung mehrerer Positionen ausgestattet ist, indem Sie eine mehrdimensionale Erfassungs-Toolbox in der Software verwenden. Erfassen Sie Hellfeld- und Epifluoreszenz-GFP/Tomatenbilder alle 5 Minuten über 12 h mit einem 20-fachen Objektiv in einer temperatur- (37 °C) und gasgesteuerten (5% CO₂₎Umgebung.

4. Bildanalyse

HINWEIS: Mit Fidschi wurden zweidimensionale (2D) Bildstapel halbautomatisch vorverarbeitet oder mit einem hausgemachten und benutzerfreundlichen Tool (verfügbar unter dieser Adresse: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md), das in IJ1-Makrosprache geschrieben ist (Abbildung 2A). Der automatisierte Workflow und die verfahren sind in Abbildung 2Bzusammengefasst.

1. Neuronale Netzwerkanalyse (Abbildung 2Bi)
   1. Wählen Sie ein Bild des Stapels aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Netzwerkwerkzeug, um das entsprechende Dialogfeld Optionen zu öffnen, und passen Sie die Einstellungen an (z. B. Schwellenwert = Dreieck, Li, Huang..., Gaußsche Unschärfeund Medianfilter = 1, 2, 3...), um eine präzise Segmentierung der Bilder zu erzeugen. Klicken Sie dann auf OK.
   2. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Netzwerk-Tool, um das folgende Verfahren automatisch zu aktivieren.
      1. Duplizieren Sie das ausgewählte Bild und teilen Sie es in drei Farbkanäle auf (Rot-Grau-Grün).
      2. Wählen Sie den Graukanal (Hellfeld) aus und führen Sie eine Kontrastdehnungsverbesserung (CSE) durch, um die Trennung zwischen verschiedenen Bereichen zu verbessern. Verwenden Sie den Sobel-Kantendetektor (SED), um den 2D-Signalverarbeitungsfaltungsvorgang auszuführen, der bereits unter dem Befehl "Kante suchen" gruppiert ist.
      3. Wenden Sie für die Doppelfilterung (F) einen Gaußschen Unschärfe- und Medianfilter an, um das Rauschen zu reduzieren und das Objektsignal zu glätten. Konvertieren Sie in Maske (CM), indem Sie angepasste Schwellenwertalgorithmen ausführen, um ein binäres Bild (BIN-grey) mit schwarzen Pixeln (Zellbereich) und weißen Pixeln (Hintergrund) zu erhalten. Skelettieren Sie (Sk) den Zellbereich in ein einfaches Netzwerk (NET) und filtern Sie Partikel (EP) in einem NET-Bild, indem Sie kleine, nicht vernetzte Partikel entfernen.
      4. Führen Sie für rote und grüne Kanäle (Kern und Membran) eine Doppelfilterungdurch, konvertieren Sie mit der angepassten Schwellenwertmethode in Maske und lassen Sie BIN-grün die Zellmorphologie mit dem Befehl Partikel analysieren bestimmen.
      5. Führen Sie alle Kanäle mit ihrem Interessenbereich (ROI) mit dem OR-Operator (Combine) zusammen und stellen Sie ihre Anfangsfarbe in ein einfaches RGB-Bild um.
2. Einzelzellmotilitätsanalyse (Abbildung 2Bii)
   1. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Einzelzellen-Tracking-Werkzeug, um das entsprechende Dialogfeld Optionen zu öffnen, und passen Sie die Einstellungen an (z. B. Trailtyp = Kern oder Membran, Schwellenwert = Dreieck, Li, Huang..., Z-Projektion = Maximale Intensität, Summenscheiben..., Gaußsche Weichzeichner und Medianfilter = 1, 2, 3...), um eine präzise Segmentierung der Bilder zu erzeugen. Klicken Sie dann auf OK.
   2. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Single Cell Tracking-Tool, um das folgende Verfahren automatisch zu aktivieren.
      1. Entfernen Sie den grauen Kanal. Wenden Sie eine Z-Projektion auf den Stapel an, die ein Bild generiert, das einem Bildstapel entsprechend der Zeit entspricht (T-Stapel). Doppelklicken Sie auf die von Zellen hinterlassenen Spuren und konvertieren Sie sie in Mask. Entfernen Sie kleine Partikel in das BIN-Rot/Grün-Bild.
      2. Wählen Sie mithilfe des ROI jede Kontur der Zellablaufverfolgung aus, und aktivieren Sie im Dialogfeld Optionen das Kontrollkästchen Kantenerkennung überspringen, um diesen Vorverarbeitungsschritt für nachfolgende Schritte zu überspringen.
      3. Isolieren Sie den roten Kanal(Trailtyp = Nucleus) auf dem ursprünglichen Stack. Wählen Sie einen ROI aus und entfernen Sie den äußeren Bereich. Filtern Sie alle Bilder doppelt und konvertieren Sie sie in Maske (BIN-rot). Bestimmen Sie die X/Y-Position des Mittelpunkts jedes binarisierten Kerns.
   3. Berechnen Sie mit einem bereits veröffentlichten Makro für die Tabellenkalkulationssoftware¹³die mittlere quadratische Verschiebung, das Richtungsverhältnis und die Durchschnittsgeschwindigkeit für diese Zelle.
3. Tracking-Analyse mehrerer Zellen (Abbildung 2Biii)
   1. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Tracking-Tool, um das entsprechende Dialogfeld Optionen zu öffnen und passen Sie die Einstellungen (z. B. Schwellenwert = Dreieck, Li, Huang..., Gaußsche Weichzeichner und Medianfilter = 1, 2, 3...) an, um eine präzise Segmentierung der Bilder zu erzeugen. Klicken Sie dann auf OK.
   2. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Tracking-Tool, um das folgende Verfahren automatisch zu aktivieren.
      1. Entfernen Sie den grauen Kanal.
      2. Teilen Sie die roten und grünen Kanäle auf, filternSie doppelt und konvertieren Sie sie in Maske.
      3. Zusammenführen der Kanäle mit Image Calculator... Befehl mit dem AND-Operator, wobei nur das Kernsignal in den Membranen übrig bleibt.
         HINWEIS: Mehrere Plugins in Fidschi können verwendet werden, um die X/Y-Position mehrerer Zellen in diesem binären vorverarbeiteten Bild gleichzeitig zu bestimmen (siehe Materialtabelle).
   3. Berechnen Sie mit einem zuvor beschriebenen Makro¹³das Trajektoriendiagramm, die mittlere quadratische Verschiebung, das Richtungsverhältnis und die durchschnittliche Geschwindigkeit für diese Zellen.
4. Sphäroidalmigration auf der Neuralmatte (Abbildung 2Biv)
   1. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Migrationswerkzeug, um das entsprechende Dialogfeld Optionen zu öffnen und passen Sie die Einstellungen an (z. B. Schwellenwert = Dreieck, Li, Huang..., Gaußsche Unschärfe und Medianfilter = 1, 2, 3...), um eine präzise Segmentierung der Bilder zu erzeugen. Klicken Sie dann auf OK.
   2. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Migrationstool, um das folgende Verfahren automatisch zu aktivieren.
      1. Entfernen Sie den roten Kanal.
      2. Teilen Sie die grünen und grauen Kanäle auf.
      3. Zeichnen Sie für den grauen Kanal manuell die Kontur der neuronalen Matte und messen Sie ihre Fläche.
      4. Für den grünen Kanal filtern Sie den Stapel doppelt und konvertieren Sie ihn in Maske. Entfernen Sie den Bereich außerhalb des Musters (BIN), und bestimmen Sie den binarisierten Zellbereich für jedes Bild.
         HINWEIS: Die oben beschriebenen Parameter werden kalibriert, indem Sie ihre Werte durch Linksklick auf das symbol von Interesse ändern. Diese Verarbeitung kann manuell erfolgen. Für eine große Anzahl von Bildern (ca. hundert pro Aufnahme), Kanäle (in der Regel 3 Kanäle) und Verarbeitungsschritte wäre jedoch ein automatisiertes oder halbautomatisches Tool vorzuziehen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Gemusterte Neuronen, die mit fluoreszierenden GBM-Zellen kokuliert wurden, wurden wie im Protokollabschnitt beschrieben vorbereitet und Tracking-Experimente durchgeführt. GBM-Zellen veränderten schnell ihre Form, während sie auf den Neuronen wanderten (Abbildung 1B: Panel 6 und Video 1). Zellen wanderten in einer zufälligen Bewegung entlang der neuronalen Erweiterungen (Video 1). Fluoreszierende GBM-Zellen und nicht fluoreszierende Neuro...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Glioblastome dringen umfassend in das Parenchym ein, indem sie verschiedene Modi verwenden: Ko-Option der umgebenden Blutgefäße, interstitielle Invasion oder Invasion auf WMTs¹⁸. Dieser letztere Modus ist in der Literatur nicht gut charakterisiert, da es schwierig ist, geeignete In-vitro- oder In-vivo-Modelle im Zusammenhang mit der WMT-Invasion zu finden. Hier wurde ein vereinfachtes Modell vorgeschlagen, bei dem kultivierte Nagetierneuronen auf lamininbeschichteten Oberfläch...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-aminopropyl) triethoxysilane	Sigma	440140-100ML	The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA
96-well round-bottom plate	Sarstedt	2582624	Used to prepare spheroids
Accutase	Gibco	A11105-01	Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme
B27	Gibco	12587	Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B	Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting ChamberSlides	Invitrogen	C10283	Used to cell counting
Coverslips	Marienfeld	111580	Cell culture substrate
Dessicator cartridges	Sigma	Z363456-6EA	Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment
DPBS 10x	Pan Biotech	P04-53-500	Stored at 4 °C
Fiji software, MTrack2 macro	ImageJ		Used to analyze pictures
Flask 75 cm²	Falcon	10497302
HBSS	Sigma	H8264-500ML
Heparin sodium	Sigma	H3149-100KU	Stored at 4 °C
Laminin		114956-81-9	Promotes neuronal adhesion
Leonardo software			loading of envisioned micropatterns
MetaMorph Software	Molecular Devices LLC	NA	Microscopy automation software
Methylcellulose	Sigma	M0512	Diluted in NBM for a 2% final concentration
Neurobasal medium	Gibco	21103-049	Stored at 4 °C
Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)			inverted microscope equipped with a motorized stage
Penicillin - Streptomycin	Gibco	15140-122	Stored at 4 °C
PLPP	Alveole	PLPPclassic_1ml	Photoinitiator used to degrade the PEG brush
Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA)	Laysan Bio	VA-PEG-VA-5000-5g	Used as an anti-fouling coating
PRIMO	Alveole	PRIMO1	Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus
Trypan blue 0.4%	ThermoFisher	T10282	Used for cell counting
Trypsin-EDTA	Sigma	T4049-100ML	Used to detach adherent cells