Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen aus dem Turner-Syndrom (45XO) fetaler Zellen zur nachgelagerten Modellierung neurologischer Defizite im Zusammenhang mit dem Syndrom

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von integrationsfreien iPS-Zellen aus fetalen Gewebefibroblasten durch Abgabe episomaler Plasmide durch Nukleofektion, gefolgt von der Beschreibung von Methoden zur iPSC-Charakterisierung und neuronalen Differenzierung.

Zusammenfassung

Chromosomale Aneuploidien verursachen schwere angeborene Fehlbildungen, einschließlich Fehlbildungen des zentralen Nervensystems und fetalem Tod. Das pränatale genetische Screening ist rein diagnostisch und klärt den Krankheitsmechanismus nicht auf. Obwohl Zellen von aneuploiden Föten wertvolles biologisches Material sind, das die chromosomale Aneuploidie trägt, sind diese Zellen kurzlebig, was ihre Verwendung für nachgelagerte Forschungsexperimente einschränkt. Die Generierung von modellen für induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) ist eine effektive Methode der Zellvorbereitung zur ständigen Erhaltung aneuploider Merkmale. Sie erneuern sich selbst und differenzieren sich zu spezialisierten Zellen, die an die Embryonalentwicklung erinnern. Daher dienen iPS-Zellen als hervorragende Werkzeuge, um frühe Entwicklungsereignisse zu untersuchen. Das Turner-Syndrom (TS) ist eine seltene Erkrankung, die mit einem ganz oder teilweise fehlenden X-Chromosom einhergeht. Das Syndrom ist gekennzeichnet durch Unfruchtbarkeit, Kleinwuchs, endokrine, metabolische, autoimmune und kardiovaskuläre Störungen und neurokognitive Defekte. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultivierung von Fibroblasten aus TS (45XO) fetalem Gewebe, die Erzeugung von integrationsfreien TSiPS-Zellen durch Abgabe von episomalen Reprogrammierungsplasmiden durch Nukleofektion mit anschließender Charakterisierung. Die reprogrammierenden TSiPS-Zellen wurden zunächst durch lebendzellige alkalische Phosphatase-Färbung gescreent, gefolgt von umfangreichen Untersuchungen nach Pluripotenz-Biomarkern. Ausgewählte Kolonien wurden mechanisch seziert, mehrmals durchquert und stabile, sich selbst erneuernde Zellen für weitere Experimente verwendet. Die Zellen exprimierten Pluripotenz-Transkriptionsfaktoren OCT4, NANOG, SOX2, Zelloberflächenmarker SSEA 4 und TRA1-81, die typisch für pluripotente Stammzellen sind. Der ursprüngliche 45XO-Karyotyp wurde nach der Neuprogrammierung beibehalten. Die TSiPS-Zellen waren in der Lage, embryoide Körper zu bilden und sich in Zellen von Endoderm, Mesoderm und Ektoderm zu differenzieren, die linienspezifische Biomarker exprimieren ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). Die exogenen episomalen Plasmide gingen spontan verloren und wurden nach Passage 15 in Zellen nicht nachgewiesen. Diese TSiPS-Zellen sind eine wertvolle zelluläre Ressource für die Modellierung defekter molekularer und zellulärer Neuroentwicklung, die neurokognitive Defizite im Zusammenhang mit dem Turner-Syndrom verursachen.

Einleitung

Aneuploidien führen beim Menschen zu Geburtsfehlern/angeborenen Fehlbildungen und Schwangerschaftsverlust. ~ 50% -70% der Proben aus Schwangerschaftsverlusten zeigen zytogenetische Anomalien. Aneuploide Embryonen, die früh in der Schwangerschaft verloren gehen, können nicht einfach für experimentelle Analysen gewonnen werden, was die Notwendigkeit erhöht, andere Modelle zu entwickeln, die die menschliche Embryogenese genau repräsentieren. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen), die aus Zellen gewonnen wurden, bei denen genetische Störungen diagnostiziert wurden, wurden verwendet, um die repräsentativen genetischen Unregelmäßigkeiten und ihre Folgen für die fetale Entwicklung zu modellieren^1,2,3,4. Diese iPS-Zellen ähneln Epiblastenzellen des sich entwickelnden Embryos und können die frühen Ereignisse der Embryonenbildung rekapitulieren. Sie ermöglichen das Verständnis und die Charakterisierung des Entwicklungsprogramms von Zelllinien und Mustern in frühen Säugetierembryonen. iPS-Zellen, die zuvor aus Hautfibroblasten und Amniozyten aus pränatalen diagnostischen Tests von Aneuploidie-Syndromen wie Monosomie X (Turner-Syndrom), Trisomie 8 (Warkany-Syndrom 2), Trisomie 13 (Patau-Syndrom) und partieller Trisomie 11 abgeleitet wurden; 22 (Emanuel-Syndrom) haben wertvolle Erkenntnisse über gescheiterte Entwicklungen geliefert⁴.

Das Turner-Syndrom (TS) ist eine seltene Erkrankung, die durch weibliche Unfruchtbarkeit, Kleinwuchs, endokrine und metabolische Störungen, ein erhöhtes Risiko für Autoimmunerkrankungen und eine Prädisposition für Herz-Kreislauf-Erkrankungen gekennzeichnet ist⁵. Obwohl es das einzige überlebensfähige Monosomie-Syndrom ist, ist es auch tödlich für den sich entwickelnden Embryo, der spontane Abtreibungen verursacht⁶. Überlebende Individuen mit TS zeigen einen Grad der Veränderung von X-chromosomalem Material in ihren Zellen. Karyotypen reichen vom vollständigen Verlust eines X-Chromosoms (45,XO) bis hin zu Mosaiken wie 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, das Vorhandensein von Ringchromosomen, das Vorhandensein von Y-chromosomalem Material usw.⁵.

Die Diagnose des Syndroms erfolgt im Allgemeinen durch Karyotypisierung von Blut von symptomatischen Personen und Chorionzottenbiopsie (CVS), um frühe Aneuploidie-Syndrome zu erkennen. Da Aneuploidie-Syndrome für ~ 30% der spontanen Abtreibungen verantwortlich sind, ist es Routine, das Produkt der Empfängnis (POC) nach einer spontanen Abtreibung zu karyotypisieren. Diese fetalen Zellen, einschließlich der Chorionzotten, die die zytogenetische Anomalie besitzen, und die daraus abgeleiteten iPS-Zellen bieten eine wertvolle Quelle für biologisches Material zur Untersuchung der Aneuploidie-Syndrome^4,6. TS iPS-Zellen wurden zuvor aus Amniozyten durch retrovirale Reprogrammierung⁴, Fibroblasten von Chorionzotten (erhalten durch pränatale Diagnostik) durch retrovirale Reprogrammierung⁶, aus mononukleären Blutzellen⁷ durch Sendai-Virus-Reprogrammierung und aus Hautfibroblasten von TS-Individuen durch lentivirale Reprogrammierung⁴ . Da das Hauptaugenmerk unseres Labors auf dem Verständnis von Entwicklungsstörungen liegt, haben wir TS iPSCs aus POC erzeugt, insbesondere die Chorionzottenkomponente einer spontanen Abtreibung⁸. Alle aus diesem fötalen Gewebe isolierten Zellen hatten einen 45XO-Karyotyp und ergaben iPS-Zellen mit dem gleichen Karyotyp. Diese iPS-Zellen sind einzigartig, da sie die ersten sind, die von einem abgetriebenen Fötus erzeugt werden und eine wertvolle Ressource zur Untersuchung von aneuploidiebedingten Schwangerschaftsfehlern darstellen. Dieser Artikel bietet eine detaillierte Methodik der Erzeugung von iPS-Zellen aus dieser einzigartigen Zellquelle durch episomale Reprogrammierung.

Die frühen Methoden der iPSC-Generierung verwendeten virale Transduktion und Transposons, um die Reprogrammierungsfaktoren zu liefern. Methoden zur Induktion von Zellen zur Pluripotenz haben sich von der Integration retroviraler^{Vektoren 9,}erregbaren lentiviralen^{Vektoren 10,11} und Transposon-basierten Methoden¹² zu nicht-integrierenden adenoviralen^{Vektoren 13} und Sendai-Virus-basierten Vektoren¹⁴entwickelt. Retrovirale und lentivirale Reprogrammierung, obwohl effizient, beinhaltet die Integration der Reprogrammierungsfaktoren in die Wirtschromosomen, was zu Insertionsmutationen führt, die unvorhergesehene Auswirkungen in den iPS-Zellen haben. Darüber hinaus verhindert die virale Reprogrammierung die translationale Anwendung von iPS-Zellen. RNA-basierte Systeme¹⁵ und direkte Proteinabgabe¹⁶ wurden untersucht, um die potenziellen Risiken, die mit der Verwendung von Viren und DNA-Transfektionen verbunden sind, vollständig zu eliminieren. Diese Methoden haben sich jedoch als ineffizient erwiesen.

Im Jahr 2011 berichteten Okita et al. über eine verbesserte Effizienz der Reprogrammierung durch episomale Plasmide, die mit TP53-Unterdrückung über shRNA verstärkt wurden. Sie ersetzten cMYC auch durch nicht transformierendes LMYC (small cell lung carcinoma associated MYC), um die Sicherheit der hiPS-Zellen zu erhöhen. Diese episomalen Plasmide exprimieren 5 Reprogrammierungsfaktoren: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC und shRNA für TP53^17,18. Diese Vektoren werden extrachromosomal beibehalten und gehen bei kontinuierlicher Kultur von den reprogrammierten Zellen verloren, wodurch die Linien innerhalb von 10-15 Passagen transgenfrei werden. Die Nukleofektion ist eine spezialisierte Form der Elektroporation, die Nukleinsäuren direkt in den Kern der Wirtszellen abgibt. Es ist eine effiziente Methode zur Abgabe der reprogrammierenden Plasmide in verschiedene Zelltypen. Episomale Plasmide sind kostengünstig und kompensieren die hohen Kosten der Nukleofektion. Diese Methode ist effizient und reproduzierbar unter optimierten Bedingungen und liefert stabile iPS-Zellen aus einer Vielzahl von somatischen Zellen. In diesem Protokoll beschreiben wir die Methode zur Erzeugung von iPS-Zellen aus Fibroblasten, die aus fetalem Gewebe durch Nukleofektion von episomalen Reprogrammierungsplasmiden isoliert wurden. Hier sind die detaillierten Protokolle für die Fibroblastenisolierung aus fetalen Chorionzotten, Plasmidreinigung, Nukleofektion, Pflücken von Kolonien von der Reprogrammierungsplatte und Etablierung stabiler iPS-Zellen.

Es ist wichtig, das Vorhandensein von Pluripotenzmerkmalen in den neu erzeugten iPS-Zellen zu bestätigen. Dazu gehören der Nachweis von pluripotenzbezogenen Faktoren (z. B. alkalische Phosphataseexpression, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-Cadherin; in der Regel mit Immunfluoreszenz- oder Genexpressionsassays gezeigt), die Identifizierung der drei Keimschichten durch In-vitro-Differenzierungstests zur Validierung ihres Differenzierungspotenzials, die Karyotypisierung zur Bestimmung des Chromosomengehalts, die STR-Typisierung zur Feststellung der Identität mit Elternzellen, die Überprüfung des Verlusts exogener Gene. und strengere In-vivo-Assays wie Teratombildung und tetraploide Komplementierung. Hier beschreiben wir Charakterisierungsprotokolle der Karyotypisierung, die alkalische Phosphatasefärbung lebender Zellen, den Nachweis von pluripotenzbezogenen Biomarkern durch Immunfluoreszenz, In-vitro-Differenzierungsassays und Methoden zum Nachweis des Verlusts exogener Gene¹⁹.

Protokoll

FCV wurden vom Manipal Hospital, Bengaluru, unter der Genehmigung der Ethikkommission der Manipal Hospitals erhalten.

HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung aller Puffer und Lösungen.

1. Isolierung von Fibroblasten aus fetalen Chorionzotten (FCV)

1. Probenentnahme und Gewebedesintegration in kollagenase
   1. FCV unter sterilen Bedingungen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) sammeln und (bei Raumtemperatur) zur Zellkulturanlage transportieren.
   2. Die Zotten in eine 60 mm Petrischale geben und mehrmals (mindestens 4 mal) in PBS mit 1x Antibiotikum Antimykotika (PBS-AA) waschen. Entfernen Sie PBS-AA vollständig durch Pipettieren.
   3. Behandeln Sie die Chorionzotten mit 1 ml Kollagenasemischung (5 mg/ml) für 5 min bei 37 °C.
   4. Mit Zellkulturmedium, das 10% fötales Rinderserum (FBS) enthält, neutralisieren, in ein 15-ml-Röhrchen überführen und 5 Minuten lang bei 225 x g zentrifugieren, um die zerfallenen Zotten und freigesetzten Zellen als Pellet zu sammeln.
2. Subkultur und Bestandserweiterung
   1. Plattenzersinkte Zotten zusammen mit freigesetzten Zellen in einem T25-Kulturkolben, der 5 ml vollständige Medien (z. B. AmnioMAX) enthält, und wachsen, bis eine konfluente Fibroblastenkultur erhalten wird.
   2. Erweitern Sie Fibroblasten in Kultur, um die Bestände für die Verwendung in nachfolgenden Transfektions- und Charakterisierungsexperimenten wie folgt vorzubereiten:
      1. 2 ml 0,05% Trypsin in den T25-Kolben mit FCV-Fibroblasten geben und bei 37 °C für 3-5 min inkubieren, um die Zellen zu dissoziieren.
      2. Neutralisieren Sie Trypsin nach der Inkubation durch Zugabe von FBS (im gleichen Volumen wie Trypsin).
         HINWEIS: Kulturmedium, das FBS enthält, kann auch verwendet werden, um Trypsin zu neutralisieren, wenn es in einem Trypsin:Medien-Verhältnis von 1:3 hinzugefügt wird.
      3. Sammeln Sie die dissoziierten Zellen in einem 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 225 x g für 5 min, um Zellpellets zu erhalten.
      4. Dekantieren Sie Überstand und resuspend Zellpellet in 1 mL komplettem Medium.
      5. Übertragen Sie je 500 μL auf 60 mm gewebekulturbehandelte Schalen und machen Sie das Volumen auf 5 mL auf. Dieses Spaltverhältnis von 1:2 wurde auch für nachfolgende Passagen verwendet.
3. Kryokonservierung
   1. Enzymatische Dissoziation unter Verwendung von 0,05% Trypsin wie in den Schritten 1.2.2.1 - 1.2.2.3 beschrieben durchführen und Zellpellet erhalten.
   2. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in 1 ml Gefriermischung, umfassend 1:9 Dimethylsulfoxid (DMSO): FBS.
   3. Geben Sie den Inhalt in ein steriles Kryovial und legen Sie die Durchstechflasche in einen Gefrierbehälter.
   4. Über Nacht bei -80 °C einfrieren und die Durchstechflaschen am nächsten Tag auf flüssigen Stickstoff (-196 °C) umfüllen.

2. DNA-Isolierung und -Verifizierung von Plasmiden

1. Bakterielle Zellvorbereitung
   1. Streakglycerinvorräte von E. coli enthalten die drei einzelnen Plasmide pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK und pCXLE-hUL (von Addgene) auf separaten Luria Bertani-Ampicillin-Agarplatten.
   2. Impfen Sie einzelne Kolonien in Starterkulturen von 5 ml Luria Bertani-Ampicillinmedium. 8 Stunden bei 37 °C unter Schütteln (10 x g) inkubieren.
   3. Impfen Sie 200 μL dieser Starterkultur in 100 ml Luria Bertani-Ampicillin-Medium. Über Nacht bei 37 °C unter Schütteln inkubieren.
   4. Ernte über Nacht Bakterienkultur durch Zentrifugieren bei 6000 x g für 15 min bei 4 °C.
2. Plasmidisolierung mit Midi-Plasmid-Reinigungskit
   1. Resuspend Bakterienpellet in 4 ml Resuspensionspuffer.
   2. Fügen Sie 4 ml Lysepuffer hinzu und mischen Sie gründlich, indem Sie 4-6 mal kräftig invertieren und bei Raumtemperatur für 5 min inkubieren.
   3. Fügen Sie 4 ml vorgekühlten Neutralisationspuffer hinzu und invertieren Sie das Röhrchen 4-6 Mal, um es gründlich zu mischen. 15 Min. auf Eis inkubieren.
   4. Zentrifuge bei ≥20.000 x g für 30 min bei 4 °C. Überstand in einem frischen Röhrchen auffangen und bei ≥20.000 x g für 15 min bei 4 °C erneut zentrifugieren.
   5. Richten Sie die Säule aus, indem Sie 4 ml Äquilibrierungspuffer auftragen.
   6. Wenden Sie den Überstand auf die Spalte an.
   7. Waschen Sie die Säule zweimal mit 10 ml Waschpuffer.
   8. Elute DNA mit 5 ml warmem (65 °C) Elutionspuffer.
   9. Niederschlag der DNA durch Zugabe von 3,5 ml Isopropanol zur eluierten DNA. Gut mischen. Zentrifuge bei ≥15.000 x g für 30 min bei 4 °C. Überstand vorsichtig dekantieren.
   10. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 2 ml 70% Ethanol und zentrifugieren Sie es bei ≥15.000 x g für 10 min. Überstand vorsichtig dekantieren.
   11. Pellet für 5-10 min an der Luft trocknen und DNA in einem geeigneten Volumen von PCR-Wasser lösen, um eine Endkonzentration von 1 μg/ml zu erhalten.
       HINWEIS: Lösen Sie DNA nicht in Puffern auf, da sie nicht für die Elektroporation geeignet ist. Alte Plasmid-DNA-Präparate ergeben keine reprogrammierten Kolonien.
3. Plasmidverifikation durch EcoRI Restriktionsaufschluss
   1. Kombinieren Sie 15 μL nukleasefreies Wasser, 2 μL 10x Puffer, 1 μg Plasmid-DNA und 1 μL EcoRI-Enzym. Vorsichtig mischen.
   2. Die Mischung bei 37 °C für 15 min in einem Hitzeblock inkubieren.
   3. Mischen Sie die verdauten Plasmidproben mit 6x DNA-Gelbeladungsfarbstoff und Elektrophorrese auf 1% Agarosegel in 1x TAE-Puffer mit 0,5 μg/ml Ethidiumbromid. Fügen Sie eine Standard-DNA-Leiter hinzu. Stellen Sie sich das Gel vor, nachdem sich die DNA entsprechend aufgelöst hat. Erwartete EcoRI-Bandgrößen von pCXLE-hOCT3 / 4-shp53-F sind 6.834 bp, 3.758 bp und 1.108 bp; pCXLE-hUL sind 10.200 bp und 1.900 bp; pCXLE-hSK sind 10.200 bp und 2.500 bp.

3. Nukleofektion

1. Zellpelletierung
   1. Kultur der isolierten fetalen Chorionzotten Fibroblasten in T25-Kolben in 5 ml vollständigem Medium bis zu 80-90% Konfluenz.
   2. Zellen zweimal mit PBS waschen und trypsinisieren, wie in den Schritten 1.2.2.1 - 1.2.2.3 beschrieben.
   3. Entfernen Sie den Überstand, resuspend Pellet in 5 ml reduziertem Serummedium (z. B. Opti-MEM). Zählen Sie Zellen mit Hämozytometer und nehmen Sie 10⁶ Zellen für die Nukleofektion. Zentrifuge bei 225 x g für 5 min. Überstand vollständig entfernen.
2. Reagenzienpräparation und Nukleofektion
   1. Herstellung des Nukleofektorreagenzes durch Mischen von 0,5 ml Ergänzung und 2,25 ml Nukleofectorlösung (beide im Kit enthalten).
   2. Fügen Sie 100 μL Nukleofectorlösung in einem 1,5 ml Röhrchen hinzu. Fügen Sie jeweils 1μg pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK und pCXLE-hUL in das Röhrchen hinzu. Resuspendieren Sie vorsichtig 10⁶ Zellen (aus Schritt 3.1.2) in dieser Mischung.
   3. Übertragen Sie die Zell-DNA-Suspension in die Küvette und stellen Sie sicher, dass die Probe den Boden der Küvette (im Kit enthalten) ohne Luftblasen bedeckt. Die Küvette verschließen und in die Halterung einsetzen. Wählen Sie das Nukleofector-Programm U-23 (für hohe Effizienz) und bewerben Sie sich.
   4. Entfernen Sie die Küvette aus der Halterung und fügen Sie 1 ml komplettes Medium hinzu. Den Inhalt schonend in eine mit 60 mm Gewebekultur behandelte Petrischale geben, die mit 4 mL kompletten Medien (auf insgesamt 5 mL Medien) gefüllt ist. Inkubieren Sie die Zellen in_einem befeuchteten CO2-Inkubator bei 37 °C.
   5. Überprüfen Sie nach 24 h, ob sich die Zellen angeschlossen haben. Ersetzen Sie das Medium vollständig.
      HINWEIS: Die Zelltodrate ist in der Nukleofektion hoch und hinterlässt nur wenige lebensfähige Zellen, die sich anheften.
   6. Halten Sie die Zellen für 10 Tage in einem vollständigen Medium und wechseln Sie für die nächsten 20 Tage zu Pluripotenzmedien.
      HINWEIS: Visualisieren Sie Zellen regelmäßig, um morphologische Veränderungen in den reprogrammierenden Zellen (wie Epithelmorphologie und kompakte Koloniebildung) zu verfolgen, um zu bestätigen, ob das Experiment funktioniert. Rund 25 iPSC-Kolonien sind nach 20 Tagen Kultur in Pluripotenzmedien zu sehen.

4. Pflücken und Vermehren von iPSC-Kolonien

1. Pflücken der Kolonie aus der Reprogrammierplatte
   1. Sezieren Sie die embryonalen stammzellähnlichen Kolonien, die in der Umprogrammierschale gebildet wurden, manuell mit gezogenen Glaspipetten oder 1 ml Spritzennadeln und übertragen Sie sie mit inaktivierten embryonalen Maus-Fibroblasten-Feedern mit Pluripotenzmedium auf eine zuvor vorbereitete Platte oder legen Sie feederfreie Kulturen auf Matrigel-beschichteten Platten mit mTESR-Medium fest.
      ANMERKUNG: Embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus wurden durch enzymatische Isolierung aus Mausembryonen (seziert von 13-14 Tagen schwangeren weiblichen Mäusen) gewonnen und durch Mitomycin C-Behandlung mitotisch inaktiviert. Etablieren Sie einzelne Klonpopulationen, indem Sie einzelne Kolonien aus der Umprogrammierung von Tellern in separaten Schalen oder gemischten Klonpopulationen züchten, indem Sie viele Kolonien von der Reprogrammierungsplatte auf eine einzige Schüssel übertragen.
2. Mechanische Übertragung von entstehenden Kolonien auf frische Feeder und Passaging zur Etablierung stabiler iPS-Zellen
   1. Vermehren Sie iPS-Zellen in Pluripotenzmedium, indem Sie jeden zweiten Tag füttern und alle 5-7 Tage 1: 3 teilen. Bereiten Sie die Bestände vor, indem Sie in einer Gefriermischung aus KnockOut Serum Replacement und DMSO im Verhältnis 9: 1 kryovorservieren.
      HINWEIS: KnockOut Serum Replacement wird in der Gefriermischung zur Kryokonservierung von iPS-Zellen anstelle von FBS verwendet, da Komponenten im FBS während der Langzeitkonservierung eine Differenzierung der pluripotenten Zellen induzieren könnten.

5. Charakterisierung von iPS-Zellen

HINWEIS: Charakterisierungsstudien einschließlich PCR und Immunfärbung für Pluripotenz-Biomarker wurden nach der fünften Passagenzahl durchgeführt. Die Karyotypisierung wurde bei einer späteren Passage durchgeführt.

1. Karyotypisierung
   1. Behandeln Sie eine konfluente 60 mm Petrischale aus iPS-Zellen mit Colcemid für 45 min im befeuchteten CO₂ -Inkubator bei 37 °C.
   2. Ernte durch 0,05% Trypsin-Behandlung und Zentrifuge. Entfernen Sie den Überstand und pipettieren Sie die übrig gebliebenen Mediumspuren, um das Zellpellet zu lösen.
   3. Fügen Sie 5 ml hypotonische Lösung hinzu. Mit invertierendem Röhrchen mischen und 20 Minuten bei 37 °C inkubieren. Zentrifuge bei 225 x g für 5 min.
      HINWEIS: Das erhaltene Pellet sollte flauschig erscheinen.
   4. Fügen Sie 2,5 ml Carnoys Fixierlösung langsam hinzu, während Sie klopfen, um das Pellet zu lösen.
   5. Bereiten Sie die Aufstriche für die Karyotypisierung vor, indem Sie die Zellsuspension auf saubere Glasobjektträger fallen lassen.
   6. Behandeln Sie die Objektträger 1 Minute lang mit 0,15% Trypsin und waschen Sie sie einmal mit PBS. Dann mit Giemsa-Lösung für 4 min färben und mit einer destillierten Wasserwäsche beenden. Akquise und Verarbeitung mit entsprechender Software.
2. Demonstration des transgenen freien Status
   1. Genomische DNA-Isolierung
      1. 20 μL Protease in den Boden eines 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchens pipettieren.
      2. Geben Sie 200 μL TSiPS-Zellen, die in PBS resuspendiert sind, in das Mikrozentrifugenröhrchen.
      3. 200 μL Buffer AL in die Probe geben und für 15 s durch Pulswirbeln mischen.
      4. 10 min bei 56 °C inkubieren.
      5. Zentrifugieren Sie kurz das Mikrozentrifugenröhrchen, um Tropfen von der Innenseite des Deckels zu entfernen.
      6. 200 μL Ethanol (96-100%) in die Probe geben und erneut für 15 s durch Pulswirbeln mischen. Nach dem Mischen das Röhrchen kurz zentrifugieren, um Tropfen von der Innenseite des Deckels zu entfernen.
      7. Tragen Sie die Mischung aus dem vorherigen Schritt vorsichtig auf die Mini-Spin-Säule (in einem 2-ml-Auffangrohr) auf, ohne den Rand zu benetzen. Schließen Sie die Kappe und zentrifugieren Sie bei 6000 x g für 1 min. Entsorgen Sie das Röhrchen, das das Filtrat enthält, und legen Sie die Mini-Spin-Säule in ein sauberes 2 ml Auffangrohr.
      8. Öffnen Sie vorsichtig die Mini-Spin-Säule und fügen Sie ohne Benetzung der Felge 500 μL Buffer AW1 hinzu. Verschließen Sie die Kappe und zentrifugieren Sie sie bei 6000 x g für 1 min. Legen Sie die Mini-Spin-Säule in ein sauberes 2 ml Auffangrohr und entsorgen Sie das Auffangrohr, das das Filtrat enthält.
      9. Öffnen Sie vorsichtig die Mini-Spin-Säule und fügen Sie 500 μL Buffer AW2 hinzu, ohne die Felge zu benetzen. Verschließen Sie die Kappe und die Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit (20.000 x g) für 3 min.
      10. Legen Sie die Mini-Spin-Säule in ein neues 2-ml-Auffangrohr und entsorgen Sie das alte Auffangrohr mit dem Filtrat. Zentrifugieren Sie mit voller Geschwindigkeit für 1 min, um die Möglichkeit eines möglichen Buffer AW2-Übertrags zu eliminieren.
      11. Legen Sie die Mini-Spin-Säule in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und entsorgen Sie das Auffangröhrchen, das das Filtrat enthält. Öffnen Sie vorsichtig die Mini-Spin-Säule und fügen Sie 200 μL Buffer AE oder destilliertes Wasser hinzu. Bei Raumtemperatur (15-25 °C) für 5 min inkubieren und dann bei 6000 x g für 1 min zentrifugieren.
   2. Transgenfreie Status-PCR (mit KAPA HiFi PCR Kit KR0368)
      1. Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien ordnungsgemäß aufgetaut und gemischt sind.
      2. Bereiten Sie eine PCR-Mastermischung vor, die das entsprechende Volumen aller Reaktionskomponenten enthält, basierend auf Tabelle 2 (Reaktionen auf Eis einrichten).
      3. Übertragen Sie die entsprechenden Volumina von PCR-Master-Mix, Template und Primer auf einzelne PCR-Röhrchen.
      4. Einzelne Reaktionen abschließen, mischen und kurz zentrifugieren.
      5. Führen Sie eine PCR gemäß Tabelle 3 durch.
3. Identifizierung von Pluripotenz-Biomarkern
   1. Färbung der alkalischen Phosphatase (AP)
      1. Bereiten Sie eine 1x AP-Live-Färbe-Arbeitslösung vor, indem Sie 3 μL 500x Stammlösung in 1,5 mL DMEM/F-12 pro 10^{cm2 Kulturfläche} verdünnen.
      2. Entfernen Sie das Medium aus der iPSC-Kulturschale. Waschen Sie die Kultur einmal mit DMEM/F-12. Geben Sie die 1x AP-Lebendflecklösung auf die iPSCs. Bei 37 °C für 45 min inkubieren.
      3. Entfernen Sie den AP-Fleck und waschen Sie ihn zweimal mit DMEM/F-12. Fügen Sie frisches DMEM / F-12 hinzu und nehmen Sie es unter dem Fluoreszenzmikroskop mit einem Standard-FITC-Filter innerhalb von 30-90 Minuten nach der Färbung auf.
   2. Immunostaining für Pluripotenz-Biomarker
      1. Konfluente iPSC-Kulturen mit 4% Paraformaldehyd über Nacht bei 4 °C fixieren. Dreimal mit PBS Tween 20 (PBST) waschen, jeweils 5 min waschen.
      2. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,3% Triton X-100 in PBST für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Dreimal mit PBST waschen.
         HINWEIS: Die Permeabilisierung sollte nur für intrazelluläre Antigene durchgeführt werden.
      3. Blockzellen mit 3% Rinderserumalbumin (BSA) in PBST für 30 min bei Raumtemperatur. Färben Sie die Zellen über Nacht mit primären Antikörpern (verdünnt 1:1000 in 1% BSA). Nach der primären Antikörperinkubation dreimal mit PBST waschen.
      4. Inkubieren Sie Zellen mit dem sekundären Antikörper (verdünnt 1:1000 in 1% BSA) für 5 h bei Raumtemperatur. Dreimal mit PBST waschen.
      5. Markieren Sie die Kerne mit 0,5 μg/ml 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) für 1 Minute. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBST.
      6. Erfassen Sie Bilder unter dem Fluoreszenzmikroskop.

6.In-vitro-Differenzierungstests

1. Embryoide Körper (EB) Differenzierung
   1. Die iPSC-Kolonien in kleine Stücke schneiden, sammeln und in Petrischalen mit niedrigem Aufsatz im embryoiden Körpermedium aufzeichnen. Züchten Sie die Zellen für 15 Tage, indem Sie das Medium alle 3 Tage ersetzen.
      HINWEIS: Die Tag-15-EBs können direkt für den Nachweis der drei Keimschicht-Biomarker verwendet werden. Alternativ können spezifische Zelllinien mit Wachstumsfaktoren induziert werden, gefolgt von einem Biomarker-Nachweis.
2. Endoderm (Hepatozyten) Differenzierung
   1. Züchten Sie die iPS-Zellen in Monolayer-Kulturen in Pluripotenzmedium.
   2. Nach dem Konfluent wechseln Sie für 2 Tage zu RPMI 1640-Medien mit 1x Insulin Transferrin Selenite und 100 ng / ml Aktivin A, gefolgt von einem Wachstum der RPMI 1640-Medien mit 30 ng / ml bFGF und 20 ng / ml BMP4 für 9 Tage. Ersetzen Sie medium alle 2 Tage.
   3. Ab Tag 10 ergänzen Medien mit 0,1 μM Dexamethason. Beenden Sie das Experiment am 20. Tag.
3. Mesoderm (Kardiomyozyten) Differenzierung
   1. Platte Tag 8 EBs auf 0,5% Matrigel-beschichteten Platten in embryoidem Körpermedium. Lassen Sie die EBs anfügen und reduzieren.
   2. Ergänzen Sie Medien mit 20 ng / ml BMP4 und wachsen Sie für 20 Tage. Ersetzen Sie das Medium alle 2-3 Tage. Beenden Sie das Experiment am 20. Tag.
4. Ektoderm (neuronale) Differenzierung
   1. Platte Tag 4 EBs auf 2 μg/cm² Kollagen Typ IV-beschichteten Platten in embryoidem Körpermedium. Lassen Sie die EBs anfügen und reduzieren.
   2. Wechseln Sie am nächsten Tag zu DMEM F-12 mit 2 mg / ml Glukose, 1x Insulin Transferrin Selenit und 2,5 μg / ml Fibronektin. Beenden Sie den Test an Tag 15.
5. Bildung von zerebralen Organoiden
   1. Züchten Sie TSiPS-Zellen in einer 35-mm-Gewebekulturschale auf MEFs bis zu 70-80% konfluent. Schneiden Sie die Kolonien ab und sammeln Sie sie in einer 15 ml Röhre. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 225 x g für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand.
   2. Waschen Sie die Koloniestücke, indem Sie sie in 2 ml PBS wiederverwenden und zentrifugieren, um den Überstand zu entfernen.
   3. Fügen Sie 1 ml 0,05% Trypsin hinzu und klopfen Sie auf die Röhre, um die Zellen zu entfernen. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C für 3-4 min, um die Koloniestücke in eine einzelne Zellsuspension zu dissoziieren.
   4. Neutralisieren Sie das Trypsin durch Verdünnung mit 4 ml Pluripotenzmedien, die 10 μg/ml Rho-assoziierte Proteinkinase (ROCK) -Inhibitor Y-27632 Dihydrochlorid (ROCKi) enthalten, um den dissoziationsinduzierten Zelltod zu verhindern.
   5. Zentrifuge, um ein Pellet zu erhalten. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml embryoidem Körpermedium, das 10 μg / ml ROCKi enthält.
   6. Entfernen Sie 10 μL Zellsuspension für die Zellzählung. Fügen Sie 10 μL Trypanblau hinzu, um abgestorbene Zellen zu erkennen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
   7. Fügen Sie der Zellsuspension ein geeignetes Volumen des embryoiden Körpermediums mit ROCKi hinzu, um 9.000 lebende Zellen pro 150 μL zu erhalten.
   8. Platte 150 μL in jeder Vertiefung einer Low-Attachment 96-Well-Platte und inkubieren in einem befeuchteten CO2-Inkubator bei 37 °C. Überprüfen Sie die Platten nach 24 Stunden auf Aggregation. Am Tag 2 das Medium vorsichtig entfernen und durch frisches embryoides Medium ohne ROCKi ersetzen.
   9. Übertragen Sie am Tag 6 EBs auf Vertiefungen mit einer niedrigen Attachment 24 Well Plate, die 500 μL neuronales Induktionsmedium enthält, bestehend aus DMEM-F12 mit 1% N2-Ergänzung, 2 mM GlutaMAX-Ergänzung und 1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren und 1 μg / ml Heparin. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage.
   10. Nach 5 Tagen in neuronales Induktionsmedium die neuroepithelialen Aggregate in Matrigel einbetten, indem ein 2 cm x 2 cm großes Quadrat Parafilm über eine leere Spitzenschale mit 200 μL-Spitzen geschichtet wird. Drücken Sie parafilm mit behandschuhten Fingern über jedes Loch in der Spitzenschale, um kleine Dellen zu machen. Reinigen Sie parafilm mit 70% Ethanol zum Sterilisieren.
   11. Übertragen Sie das Parafilmquadrat in eine 60-mm-Schale. Verwenden Sie geschnittene 200 μL-Spitzen, um die neuroepithelialen Aggregate auf die Dellen im Parafilm zu übertragen. Entfernen Sie überschüssiges Medium durch Pipettieren.
   12. 30 μL aufgetautes Matrigel auf die neuroepithlialen Aggregate geben und das Aggregat mit einer Pipettenspitze in der Mitte des Matrigels positionieren. Stellen Sie die 60-mm-Schale für 20-30 min in einen 37 °C-Inkubator, damit das Matrigel polymerisieren kann.
   13. Fügen Sie 5 ml zerebrales Organoid-Differenzierungsmedium hinzu, bestehend aus 1:1 DMEM-F12: Neurobasales Medium, 0,5% N2-Präparat, 2,5 μg/ml Insulin, 2 mM GlutaMAX-Präparat, 0,5 mM NEAA, 1% B27-Präparat und 2,5 ml Penicillin-Streptomycin.
   14. Drehen Sie mit einer sterilen Pinzette die Parafilmfolie um und rühren Sie die Schale, bis die in Matrigel eingebetteten Aggregate von der Folie in das Medium fallen. Züchten Sie die eingebetteten Aggregate in einem befeuchteten CO₂ -Inkubator bei 37 ° C für 4 Tage und geben Sie an wechselnden Tagen Medienwechsel.
   15. Nach 4 Tagen statischer Kultur legen Sie die 60-mm-Schalen auf einen orbitalen Shaker, der im Inkubator installiert ist und mit 50 U / min schüttelt. Kultivieren Sie die Organoide für 3 Monate und geben Sie alle 3 Tage vollständige Medienveränderungen mit zerebralem Organoid-Differenzierungsmedium.

Ergebnisse

Generierung von integrationsfreien iPS-Zellen aus einem spontan abgetriebenen Fötus mit 45XO-Karyotyp
Wir isolierten Fibroblasten aus FCV mit einem Turner-Syndrom (TS)-spezifischen 45XO-Karyotyp und nukleofizierten sie mit episomalen Reprogrammierungsplasmiden, um TSiPS-Zellen zu erzeugen, die für die nachgeschaltete Modellierung des Syndroms, insbesondere der damit verbundenen neurologischen Defizite, verwendet werden können (Abbildung 1a& b). Für di...

Diskussion

Die Erzeugung stabiler zellulärer Modelle zytogenetisch abnormalen fetalen Gewebes ist notwendig, um einen defekten Phänotyp aufrechtzuerhalten. Der iPSC-Weg ist die effektivste Methode der Zellvorbereitung zur ständigen Erhaltung defekter Eigenschaften²⁰.

Pluripotente Stammzellen (PSC) zeigen Eigenschaften der Selbsterneuerung und Differenzierung in spezialisierte Zellen, die an frühe Spaltungsembryonen erinnern²¹. Daher können PSCs als her...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15% trypsin	Thermo Fisher Scientific	27250018	G Banding
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985023	Pluripotency and Embryoid body medium
4', 6 diamidino-2-phenylindole	Sigma Aldrich	D8417	Immunocytochemistry
Activin A	Sigma Aldrich	SRP3003	Differentiation assays
Alkaline Phosphatase Live Stain	Thermo Fisher Scientific	A14353	AP staining
AMAXA Nucleofector II	Lonza	-	Nucleofection
AmnioMAX II complete media	Thermo Fisher Scientific, Gibco	11269016	Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures
Ampicillin	HiMedia	TC021	Plasmid purification
Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11059	Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11034	Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunocytochemistry
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15240096	Contamination control
Anti-E-Cadherin	BD Biosciences	610181	Immunocytochemistry
Anti-Nanog	BD Biosciences	560109	Immunocytochemistry
Anti-OCT3/4	BD Biosciences	611202	Immunocytochemistry
Anti-SOX17	BD Biosciences	561590	Immunocytochemistry
Anti-SOX2	BD Biosciences	561469	Immunocytochemistry
Anti-SSEA4	BD Biosciences	560073	Immunocytochemistry
Anti-TRA 1-81	Millipore	MAB4381	Immunocytochemistry
basic Fibroblast Growth Factor[FGF2]	Sigma Aldrich	F0291	Pluripotency medium
Bone Morphogenetic Factor 4	Sigma Aldrich	SRP3016	Differentiation assays
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A3059	Blocking
Collagen Human Type IV	BD Biosciences	354245	Differentiation assays
Collagenase blend	Sigma Aldrich	C8051	Digestion of foetal chorionic villi
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902	Differentiation assays
DMEM F12	Thermo Fisher Scientific	11320033	Differentiation assays
FastDigest EcoR1	Thermo Scientific	FD0274	Restriction digestion
Fibronectin	Sigma Aldrich	F2518	Differentiation assays
Giemsa Stain	HiMedia	S011	G Banding
Glacial Acetic Acid	HiMedia	AS001	Fixative for karyotyping
Glucose	Sigma Aldrich	G7528	Differentiation assays
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061	Pluripotency and Embryoid body medium
Heparin sodium	Sigma Aldrich	H3149	Differentiation assays
Insulin solution human	Sigma Aldrich	I9278	Differentiation assays
Insulin Transferrin Selenite	Sigma Aldrich	I1884	Differentiation assays
KAPA HiFi PCR kit	Kapa Biosystems	KR0368	OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX Colcemid	Thermo Fisher Scientific	15210040	Mitotic arrest for karyotyping
KnockOut DMEM	Thermo Fisher Scientific	10829018	Pluripotency and Embryoid body medium
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828028	Pluripotency and Embryoid body medium
Luria Bertani agar	HiMedia	M1151F	Plasmid purification
Matrigel	BD Biosciences	356234	Differentiation assays
MEM Non-essential amino acids	Thermo Fisher Scientific	11140035	Pluripotency and Embryoid body medium
Methanol	HiMedia	MB113	Fixative for karyotyping
Myosin ventricular heavy chain α/β	Millipore	MAB1552	Immunocytochemistry
NHDF Nucleofector Kit	Lonza	VAPD-1001	Nucleofection
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148	Fixing cells
pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F	Addgene	27077	Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hSK	Addgene	27078	Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hUL	Addgene	27080	Episomal reprogramming Plasmid
Penicillin Streptomycin	Thermo Fisher Scientific,	15070063	Pluripotency and Embryoid body medium
Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma Aldrich	P1951	Immunocytochemistry
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P4417	1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving Storage: Room temperature. PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. Storage: Room temperature.
Plasmid purification Kit- Midi prep	QIAGEN	12143	Plasmid purification
Potassium Chloride Solution	HiMedia	MB043	Hypotonic solution for karyotyping
QIAamp DNA Blood Kit	Qiagen	51104	Genomic DNA isolation
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875093	Hepatocyte differentiation medium
Sodium Citrate	HiMedia	RM255	Hypotonic solution for karyotyping
Triton X-100	HiMedia	MB031	Permeabilisation
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermo Fisher Scientific, Gibco	25300054	Subculture of  foetal chorionic villi fibroblasts
Tween 20	HiMedia	MB067	Preparation of PBST
β III tubulin	Sigma Aldrich	T8578	Immunocytochemistry
Y-27632 dihydrochloride	Sigma Aldrich	Y0503	Differentiation assays