Single Myofiber Culture Assay zur Beurteilung der Funktionalität adulter Muskelstammzellen ex vivo

Zusammenfassung

In diesem Protokoll wird eine In-vitro-Kultivierungs- und Funktionsanalysemethode für Muskelstammzellen beschrieben, die die meisten ihrer Wechselwirkungen mit ihrer endogenen Nische bewahrt.

Zusammenfassung

Adultes Skelettmuskelgewebe beherbergt eine Stammzellpopulation, die für ihre Regenerationsfähigkeit unverzichtbar ist. Bei Muskelschäden verlassen Muskelstammzellen ihren ruhenden Zustand und aktivieren das myogene Programm, was letztendlich zur Reparatur von geschädigtem Gewebe führt, das mit der Auffüllung des Muskelstammzellpools einhergeht. Verschiedene Faktoren beeinflussen die Aktivität der Muskelstammzellen, darunter intrinsische Reize, aber auch Signale aus der direkten Muskelstammzellumgebung, der Stammzellnische. Die Isolierung und Kultur einzelner Myofiber mit ihren zugehörigen Muskelstammzellen bewahrt den größten Teil der Interaktion der Stammzelle mit ihrer Nische und ist daher die engste Möglichkeit, die Funktionalität von Muskelstammzellen ex vivo zu untersuchen. Hier wird ein Protokoll für die Isolierung, Kultur, siRNA-Transfektion und Immunfärbung von Muskelstammzellen auf ihren jeweiligen Myofibern aus Maus-EDL-Muskeln(Extensor digitorum longus)bereitgestellt. Die hier skizzierten experimentellen Bedingungen erlauben die Untersuchung und Manipulation von Muskelstammzellen ex vivo einschließlich der Untersuchung der myogenen Aktivität ohne die inhärente Notwendigkeit von In-vivo-Tierversuchen.

Einleitung

Skelettmuskel beim Erwachsenen ist ein postmitotisches Gewebe, das hauptsächlich aus mehrkernigen Myofibern besteht, die die Effektorzellen für willkürliche Bewegungen sind. Es hat eine bemerkenswerte Fähigkeit zur Regeneration, ein Prozess, der der embryonalen Myogenese ähnelt und Beeinträchtigungen in Alter und Krankheit erfährt¹. Diese auffallende Regenerationsfähigkeit der Skelettmuskulatur hängt von Muskelstammzellen (MuSCs) ab, die aufgrund ihrer Lage zwischen dem Sarkolemma und der Basallamina der Myofiber auch als Satellitenzellen bezeichnet werden^2,3. Unter Ruhebedingungen sind MuSCs ruhend und durch die Expression des Transkriptionsfaktors Pax7 und Ruhemarker wie Sprouty1⁴, 5^,6,7,8gekennzeichnet. Bei Aktivierung, z.B. nach Verletzung, verlassen MuSCs den Ruhezustand und regulieren den myogenen Regulationsfaktor MyoD^{9 hoch.} Die Pax7/MyoD-doppelpositiven MuSCs vermehren und differenzieren sich dadurch und erzeugen myogene Vorläuferzellen, die oft auch als Myoblasten bezeichnet werden. Diese Myoblasten differenzieren sich dann weiter zu länglichen Myozyten, ein Prozess, der mit molekularen und morphologischen Veränderungen zusammenfällt, z. B. Verlust von Pax7 und Hochregulierung der Myogenin-Expression¹⁰. Myozyten verschmelzen dann schließlich miteinander oder mit bestehenden Myofibern, wodurch das beschädigte Gewebe repariert wird. Wichtig ist, dass ein kleiner Bruchteil der Muskelstammzellen die MyoD-Hochregulierung umkehrt und in der Lage ist, sich selbst zu erneuern¹¹. Der Status der MuSC-Differenzierung und myogenen Progression kann durch die Untersuchung myogener Marker wie Pax7, MyoD und Myogenin¹⁰leicht beobachtet werden.

Die Kultur einzelner Myofiber mit ihren benachbarten MuSCs ist eine hervorragende Methode, um die MuSC-Funktionalität in einer Ex-vivo-Umgebung zu untersuchen, da MuSCs in ihrer endogenen Nische verbleiben^12,13. Das Verhalten von MuSCs wird sowohl durch intrinsische Signale als auch durch extrinsische Signale reguliert, die von der Nische bereitgestellt werden, einer spezialisierten anatomischen Position, die Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) umfasst, die die MuSCs und das Myofiber selbst umgibt. Zum Beispiel ist einer der extrinsischen Regulatoren der MuSC-Ruhephase die Notch-Signalisierung. Hier werden Signalsignale von MuSCs sowohl vom Myofiber als auch vom ECM^14,15,16empfangen. Darüber hinaus ist die MuSC-Nische wichtig, um die Teilungsachse von MuSCs zu kontrollieren und so das Zellschicksal von MuSC-Tochterzellen zu regulieren^17,18. Vernünftigerweise können Parameter wie asymmetrische MuSC-Divisionen, myogene Progression und Selbsterneuerung in diesem Versuchsaufbau eindeutig bewertet werden. Zum Beispiel kann sich aus einem MuSC nach einer 72-stündigen Kulturperiode ein mehrzelliger Cluster bilden, der auf das Auftreten und den Prozentsatz unterschiedlicher myogener Populationen wie selbsterneuernde, proliferierende und weiter differenzierte MuSCs^8,19,20,21untersucht werden kann. Der Differenzierungszustand von MuSCs kann durch Untersuchung der Expression/Co-Expression von Pax7, MyoD und Myogenin bestimmt werden. Nach 72 h Kultur können die Zellen in einem Cluster durch folgende Parameter unterschieden werden: Pax7-only-Zellen sind selbsterneuernde MuSCs, während Pax7/MyoD-Doppelpositive Zellen muSCs proliferieren/aktivieren und weiter differenzierte myogene Zellen Myogenin-positiv sind²². Weiterhin können neben der myogenen Progression auch MuSC-Zahlen oder der Wiedereintritt in den Zellzyklus/die Aktivierung untersucht werden, z.B. durch Immunfluoreszenz-basierte Analysen auf Basis der oben beschriebenen Parameter.

Hier werden die Besonderheiten des myofiber Isolations- und Kulturprotokolls, z.B. die Erhaltung der Interaktion des MuSC mit seiner Nische, beschrieben. Die ganzen EDL-Muskeln(Extensor digitorum longus)der Maus werden sorgfältig seziert, von kollagenase verdaut und physisch verreibungen, um einzelne Myofiber mit ihren zugehörigen MuSCs für die weitere Kultur zu erhalten. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll die Schritte zur Transfizierung von MuSCs mit siRNA für funktionelle Analysen von Kandidatengenen und konsekutive Immunfluoreszenz-basierte Analysen ohne die Notwendigkeit transgener Tiere.

Protokoll

Das Opfern von Tieren muss in Übereinstimmung mit den nationalen Vorschriften für Tierversuche erfolgen. Das hier beschriebene Protokoll wurde nach den Richtlinien des Leibniz-Instituts für Altern - Fritz-Lipmann-Institut und der Richtlinie 2010/63/EU der Europäischen Union (EU) (Lizenznummer für organraubende Maßnahmen: O_JvM_18-20) durchgeführt. Wesentliche Schritte des Protokolls sind in Abbildung 1zusammengefasst.

1. Vorbereitung von Kulturtellern, Medien und Pasteurpipetten

HINWEIS: Alle Materialien und Geräte, die zur Isolierung und Kultivierung einzelner Myofiber erforderlich sind, müssen so steril wie möglich sein. Daher wird empfohlen, einzelne Myofiber unter einer halbsterilen Dissektionshaube zu isolieren.

1. Verwenden Sie steriles HS (Pferdeserum), um Gewebekulturplatten zu beschichten. Die Beschichtung verhindert die Anhaftung einzelner Myofiber an der Kunststoffoberfläche. Für jede Maus werden 4 Vertiefungen einer 12-Well-Platte für die Isolierung und eine dedizierte Anzahl von Vertiefungen einer 24-Well-Platte für die Kultivierung benötigt. Inkubieren Sie die Vertiefungen einer 12-Well-Platte mit 1 ml und die Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit 0,5 mL HS für 5 min bei RT (Raumtemperatur), entfernen Sie dann das HS und lassen Sie die Platten weitere 5 min trocknen.
   HINWEIS: HS kann gesammelt und für Beschichtungszwecke mehrmals wiederverwendet werden, wenn es steril gehalten wird.
2. Herstellung eines Myofiber-Isolationsmediums durch Ergänzung von DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium mit 4,5 g/L Glucose und Natriumpyruvat) mit 20% FBS (fetales Rinderserum), Filter durch 0,22 μm Filter. Den vorbeschichteten Isolationsplatten (12-Well-Platte, 2-4 ml Isolationsmedium pro Bohrung) ca. 30 min vor der Isolierung Medium zuführen und in einem befeuchteten 37 °C Inkubator mit 5%_CO2ausgleichen.
3. Bereiten Sie das Myofiberkulturmedium vor, indem Sie DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium mit 4,5 g / L Glukose und Natriumpyruvat) mit 20% FBS (fetales Rinderserum) und 1% Hühnerembryoextrakt ergänzen, durch 0,22 μm Filter filtern. Jeder Vertiefung der vorbeschichteten Kulturplatten (24-Well-Platte) ca. 30 min vor der Isolierung 0,5 mL Medium zuführen und in einem befeuchteten 37 °C Inkubator mit 5%_CO2ausgleichen.
4. Herstellung einer Kollagenase-Verdauungslösung durch Lösen von 0,2% (w/v) Kollagenase Typ 1 (aus Clostridium histolyticum)in DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium mit 4,5 g/L Glucose und Natriumpyruvat), Filter durch 0,22 μm Filter. Für zwei EDL(extensor digitorum longus)Muskeln verwenden Sie 2,5 ml Kollagenaselösung in einem sterilen 15 ml Reaktionsröhrchen. Zusätzlich wird die Lösung ~10 min in einem zirkulierenden Wasserbad bei 37 °C vorgewärmt, bevor mit der Isolierung begonnen wird.
5. Bereiten Sie sterile Pasteur-Pipetten für die Verreibung der kollagenaseverdauten Muskeln vor. Verwenden Sie einen Diamantstift, um die Pasteur-Pipetten zu schneiden.
   1. Verwenden Sie für jede Maus eine Großbohrungspipette mit einer Öffnung von ca. 0,3 cm und einer Länge von ca. 10-12 cm und eine zweite Glaspipette mit einer kleinen Öffnung von ca. 0,1 cm und einer Länge von ca. 22 cm (Abbildung 2F).
   2. Glätten Sie die Kanten beider Pipetten durch Hitzepolieren mit der Flamme eines Bunsenbrenners. Halten Sie die Pipettenspitze mit sanfter Bewegung für 5-10 s in die Flamme, um eine gleichmäßige Wärmeverteilung zu ermöglichen, bis sich die scharfen Glaskanten glätten.
   3. Beschichten Sie unmittelbar vor Gebrauch beide Arten von Glaspipetten mit sterilem HS, indem Sie die gesamte Pipette für 5 min mit ~ 2 ml HS füllen, anschließend das HS auswerfen und die Pipetten bei RT 5 min trocknen lassen.

2. EDL-Muskelisolierung und Kollagenase-Verdauung

1. Besprühen Sie alle Geräte mit 70% Ethanol, um eine Kontamination zu vermeiden.
2. Opfern Sie die Maus gemäß den nationalen Vorschriften für Tierversuche.
3. Besprühen Sie die Hinterbeine der Maus mit 70% Ethanol. Verwenden Sie eine gehärtete, fein gebogene Schere (24 mm Schneide) und eine feine Pinzette (Dumont 7, gekrümmt oder gerade), um die Haut zu entfernen und die darunter liegenden Muskeln freizulegen. Vermeiden Sie jeden Kontakt der darunter liegenden Muskeln mit Fell (erhöht das Risiko einer Kontamination).
4. Entfernen Sie die umgebende Faszie mit einer fein gekrümmten Pinzette, ohne die darunter liegenden Muskeln zu beschädigen (Abbildung 2A). Schließen Sie die Pinzette, um ein Verbiegen zu vermeiden.
5. Verwenden Sie eine gekrümmte Pinzette, um die distalen Sehnen des TA (Tibialis anterior) und des EDL-Muskels freizulegen. Um die TA zu entfernen, greifen Sie die distale TA-Sehne mit pinzette und schneiden Sie mit einer feinen Vannas-Federschere (5 mm Schneide, 0,35 mm Spitzendurchmesser). Während Sie den TA an der Sehne halten, ziehen Sie ihn in Richtung Knie und schneiden Sie den Muskel in der Nähe des Knies ab (Abbildung 2B), der EDL-Muskel ist nun freigelegt.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass in diesem Schritt nur die TA-Sehne gegriffen wird, da sonst das zugrunde liegende EDL beschädigt werden könnte. Achten Sie beim Abschneiden des TA-Muskels darauf, dass die Sehnen am Knie danach gut zu sehen sind.
6. Heben Sie die distale EDL-Sehne mit einer fein gekrümmten Pinzette an und schneiden Sie sie mit einer feinen Vannas-Federschere (Abbildung 2C). Legen Sie die proximale EDL-Sehne frei, indem Sie die EDL vorsichtig in Richtung Knie ziehen. Schneiden Sie die proximale Sehne mit einer feinen Vannas-Federschere ab. Übertragen Sie den EDL-Muskel auf die 37 °C vorgewärmten 2,5 ml Kollagenase-Verdauungslösung im 15 mL Reaktionsröhrchen aus Schritt 1.4. (Abbildung 2D).
   HINWEIS: Machen Sie einen kleinen Schnitt am oberen Kniebindegewebe, um die proximale EDL-Sehne vollständig freizulegen. Achten Sie darauf, nur die Sehnen zu greifen und die EDL nicht zu sehr zu dehnen.
7. Wiederholen Sie die Schritte 2.3. bis 2.6. mit der zweiten EDL. Beide EDL-Muskeln in dasselbe 15-ml-Reaktionsröhrchen geben, das mit 2,5 ml Kollagenase-Verdauungslösung gefüllt ist.
8. Inkubieren Sie die EDL-Muskeln im Reaktionsschlauch bei 37 °C in einem zirkulierenden Wasserbad.
   HINWEIS: Die Inkubationszeit hängt von mehreren Faktoren ab, wie z.B. Kollagenaseaktivität, Alter der Maus und Menge an fibrotischem Gewebe. Die typische Inkubationszeit für EDL-Muskeln erwachsener Mäuse (2-6 Monate) beträgt 1-1,5 h und für gealterte Mäuse (18 Monate) 1,5-2 h.
9. Um eine übermäßige Verdauung der Muskeln zu vermeiden, überprüfen Sie die Muskeln während der Verdauungszeit. Stoppen Sie die Verdauung, wenn sich die Muskeln lockern und einzelne Myofiber sichtbar sind (Abbildung 2E). Übertragen Sie die Muskeln vorsichtig mit der Pipette mit großer Bohrung in die erste Vertiefung der vorgewärmten 12-Well-Platte, die myofiberisolierendes Medium enthält (Abbildung 2G).

3. Myofiber-Dissoziation und Kultur

1. Für die folgenden Schritte verwenden Sie ein Stereo-Binokularmikroskop, vorzugsweise ausgestattet mit einer Heizplatte (37 °C). Verwenden Sie die Pipette mit großer Bohrung, um die Muskeln mit warmem Isolationsmedium zu spülen, bis einzelne Myofiber freigesetzt werden. Dissoziieren Sie die Muskeln mit der Großbohrungspipette, bis die gewünschte Anzahl von Myofibern frei in der Lösung schwimmt.
   HINWEIS: Vermeiden Sie übermäßige Verreibungen, um das Risiko beschädigter Myofiber zu verringern. Die Verwendung einer Heizplatte zur Myofiberdissoziation wird dringend empfohlen, da die Temperatur während des Isolationsprozesses abfällt, was zum Tod von Myofiber führt.
2. Übertragen Sie nicht kontrahierte Myofiber (Abbildung 2H) mit der HS-beschichteten Glaspipette mit kleiner Bohrung in die zweite mit Isolationsmedium gefüllte Vertiefung, um Ablagerungen und kontrahierte (beschädigte) Myofiber abzuwaschen (Abbildung 2I).
   HINWEIS: Um eine übermäßige Bewegung isolierter Myofiber zu vermeiden, können sie in die zweite Vertiefung übertragen werden und dann kann der Verreibungsprozess fortgesetzt werden.
3. Übertragen Sie nicht kontrahierte Myofiber auf die nächste^(3.)gut mit Isolationsmedium gefüllte, um sie erneut zu waschen.
4. Verwenden Sie die mit HS beschichtete Glaspipette mit kleiner Bohrung, um etwa 50-100 nicht kontrahierte Myofiber auf die 24-Well-Platte mit Myofiberkulturmedium zu übertragen.
5. Myofiber bei 37 °C inkubieren, 5% CO₂ für die vorgesehene Zeit (maximal 96 h werden empfohlen).
   HINWEIS: MuSCs teilen sich einmal entweder planar oder apikal-basal nach 42 h Kultur. Zusätzlich bilden MuSCs nach 72 h Kultur mehrzellige Cluster, die aus sich selbst erneuernden, proliferierenden oder engagierten (differenzierten) MuSCs bestehen.

4. siRNA-Transfektion

1. 4 h nach der Myofiberisolierung myofiberassoziierte MuSCs (50-100 nicht kontrahierte Myofiber in einer Vertiefung der mit 500 μL-Kulturmedium gefüllten 24-Well-Platte) mit lipidbasiertem Transfektionsreagenz, z.B. RNAiMAX gemäß Herstellerprotokoll mit einer Endkonzentration von 5 pmol siRNA. Fügen Sie daher 25 μL Opti-MEM mit dem jeweiligen Volumen der siRNA zu 25 μL Opti-MEM hinzu, die 1,5 μL des Transfektionsreagenzes enthalten. Die Reaktionsmischung für 5 min inkubieren und dann in das 500 μL Kulturmedium geben.
   HINWEIS: Eine zweite Transfektion nach 24 h oder 48 h wird für längere Kulturperioden empfohlen, z. B. mehr als 48 h. Ein Mediumwechsel nach der Transfektion ist nicht notwendig.

5. Fixierung und IF-Färbung

1. Zur Immunfärbung verwenden Sie ein Stereo-Binokularmikroskop. Alle Volumina in den folgenden Schritten werden auf eine Vertiefung einer 24-Well-Platte eingestellt. Führen Sie alle folgenden Schritte mit einer HS-beschichteten Kleinrohrpipette aus.
2. Verwerfen Sie vorsichtig das Myofiberkulturmedium, während Sie etwas Lösung im Bohrloch belassen (ca. 100 μL pro 24-Well). Tun Sie dies für alle weiteren Schritte, sofern nicht anders angegeben, um das Schweben der Myofiber zu ermöglichen. Fügen Sie 500 μL 2% PFA hinzu, um die Myofiber mit ihren benachbarten MuSCs zu fixieren, inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur (RT).
3. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und waschen Sie die Myofiber dreimal mit PBS (pH 7,4, 500 μL für jeweils 5 min bei RT).
4. 500 μL Permeabilisierungslösung (0,1% Triton X-100, 0,1 M Glycin in PBS, pH 7,4) zugeben und 10 min bei RT inkubieren.
5. Entfernen Sie die Permeabilisierungslösung und fügen Sie 500 μL Blockierende Lösung (5% HS in PBS, pH 7,4) für 1 h bei RT hinzu.
   HINWEIS: Überprüfen Sie die empfohlene Blockierungslösung auf primäre Antikörper, um eine unspezifische Bindung zu vermeiden.
6. Entfernen Sie die Blockierende Lösung und fügen Sie 300 μL primäre Antikörperverdünnung (z. B. Anti-Pax7 (PAX7, DSHB, unverdünnt), Anti-MyoD (Klon G-1, Santa Cruz, 1:200)) pro Vertiefung hinzu. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
7. Dreimal mit 500 μL PBS pro Vertiefung waschen (5 min bei RT).
8. Entfernen Sie PBS und fügen Sie 300 μL sekundäre Antikörperverdünnung (z. B. Anti-Maus-IgG1-546 und Anti-Maus-IgG2b-488 1:1000) pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie 1 h bei RT vor Licht geschützt. Für die folgenden Schritte werden lichtreduzierte Bedingungen empfohlen.
9. Zweimal mit 500 μL PBS pro Vertiefung waschen (5 min bei RT).
10. Führen Sie die DAPI-Färbung durch, indem Sie 500 μL der Lösung pro Vertiefung (endgültige DAPI-Konzentration 10 μg/ml) für 5 min bei RT verwenden.
11. Zweimal mit 500 μL PBS pro Vertiefung waschen (5 min bei RT).
12. Verwenden Sie einen hydrophoben Stift, um einen Kreis auf einem mikroskopisch kleinen Glasobjektträger zu zeichnen, um eine wasserabweisende Barriere zu schaffen, die das Verschütten von Flüssigkeit, die Myofiber enthält, verhindert. Übertragen Sie die Myofiber in möglichst kleinem Volumen auf den mikroskopisch kleinen Glasobjektträger und verteilen Sie sie auf dem Glasobjektträger.
    HINWEIS: Vermeiden Sie das physische Ziehen der Myofiber über den mikroskopisch kleinen Glasobjektträger, da dies zu Reibung führen kann, die zu einer Ablösung von Clustern von Myofibern führt.
13. Entfernen Sie die Restflüssigkeit mit der Kleinrohr-Pasteurpipette oder einer 200-μL-Pipette.
14. Verwenden Sie zwei Tropfen wässriges Montagemedium und bedecken Sie die Myofiber mit einem Deckglas. Lassen Sie die Objektträger für die vom Hersteller empfohlene Zeit trocknen. Lagern Sie die Dias bei 4 °C im Dunkeln.

Ergebnisse

Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die erfolgreiche Ableitung und Kultur einzelner Myofiber mit ihren zugehörigen MuSCs aus murinen EDL-Muskeln. Wesentliche Schritte des Protokolls sind in Abbildung 1zusammengefasst. Eine sorgfältige Sehnen-zu-Sehnen-Dissektion der EDL-Muskeln (Abbildung 2A-C) ist entscheidend für eine hohe Ausbeute an lebensfähigen Myofibern. Die Muskeldissoziation wird zunächst durch Kollagenase-Verdauung (Abbildung 2D) gefolgt von körperlicher Verreibung (Abbildung 2G )erreicht. Intakte Myofiber (Abbildung 2H) werden kultiviert, während hyperkontraktierte und tote Myofiber (Abbildung 2I) von der Kultur und Analyse ausgeschlossen werden sollten.

MuSCs bleiben während des Isolationsprozesses myofiberassoziiert. Die Immunfluoreszenzfärbung für den Transkriptionsfaktor Pax7 identifiziert und unterscheidet 7-9 MuSC-Kerne von der Fülle von Myonukleien pro Myofiber, wenn sie direkt nach Abschluss des Isolationsprozesses fixiert werden (Abbildung 3A). Abbildung 3B zeigt einen vergrößerten Bereich aus Abbildung 3A mit dem zusätzlichen Hellfeldkanal, der die subzelluläre myofibrilläre Struktur der Myotube freilegt und das Pax7-Immunfluoreszenzsignal im Kern eines MuSC zeigt.

Die Aktivierung und myogene Progression von Myofiber-assoziierten MuSCs kann durch myogene Markerexpression analysiert werden. Assoziiert mit frisch isolierten Myofibern (0 h) finden sich meist ruhende MuSCs, die durch Pax7-Expression und Abwesenheit der MyoD-Expression gekennzeichnet sind und damit einem in vivo homöostatischen Zustand ähneln(Abbildung 4, 0 h). Aufgrund des Dissektions-/Dissoziationsverfahrens und der Myofiberkultur-Medienzusammensetzung aktivieren und reregulieren die MuSCs schnell den Transkriptionsfaktor MyoD, um die Proliferation zu erleichtern, wie es nach 42 Stunden beobachtet werden kann, wenn MuSCs ihre erste Teilung durchlaufen haben(Abbildung 4, 42 h). Nach 72 Stunden Kultur bilden MuSCs Cluster von Nachkommen mit unterschiedlichen myogenen Schicksalen, die von den Expressionsmustern verschiedener myogener Marker begleitet werden(Abbildung 4, 72 h). Pax7+ nur Zellen widerstehen der Differenzierung und werden zu sich selbst erneuernden Stammzellen. Pax7+ und MyoD+ doppelpositive Zellen sind proliferativ, während MyoD+ nur Zellen entlang der myogenen Linie weiter fortgeschritten sind und sich differenzieren werden.

Das Myofiberkultursystem ermöglicht eine effiziente Interferenz der MuSC-Aktivität durch verschiedene Interventionen, von denen eine die siRNA-Transfektion ist, wie in diesem Protokoll ausführlich beschrieben. Um die Transfektionseffizienz von Myofiber-assoziierten MuSCs zu überwachen, wurde eine fluoreszierend markierte Nicht-Targeting-siRNA transfiziert. Pax7-positive MuSCs akkumulierten zytoplasmatische siRNA in einer granulatartigen Weise, was auf eine effiziente Aufnahme hinweist (Abbildung 5A). Im Zytoplasma von Myofibern wurden keine fluoreszierenden Granula beobachtet, was auf eine natürliche Aufnahmebarriere in Myofibern bei 4 h nach der Isolierung hindeutet und dass die siRNA-Transfektion spezifisch auf MuSCs abzielt. Die Quantifizierung von positiv transfizierten Pax7+-Zellen pro Myofiber ergab, dass mehr als die Hälfte aller MuSCs kurz vor Abschluss der ersten Teilungsrunde nach 24 Stunden sichtbare Mengen fluoreszierend markierter siRNA aufgenommen hatten. Die Anzahl der transfizierten Pax7+-Zellen stieg nach 30 Stunden weiter auf bis zu 74% an (Abbildung 5B). Darüber hinaus gab es keinen Unterschied in der Anzahl der Pax7+-Zellen pro Myofiber von transfizierten oder nicht transfizierten Zuständen zu beiden Zeitpunkten, was aufgrund des Transfektionsverfahrens keine nachteiligen Auswirkungen auf die Stammzellzahlen zeigte (Abbildung 5C).

Zusammenfassend bietet das Protokoll eine detaillierte Beschreibung der Isolierung und Kultur von EDL-Einzelmyofibern mit ihren benachbarten Muskelstammzellen. Es ermöglicht die Untersuchung der Myofiber-assoziierten Muskelstammzellaktivität ex vivo, z.B. durch Immunfluoreszenz-basierte Analysen. Die Manipulation von Muskelstammzellen durch siRNA-Transfektion ist effizient und liefert eine methodische Grundlage für Funktionsanalysen.

Abbildung 1: Schematische Zusammenfassung der wesentlichen Schritte. Die wesentlichen Schritte des Isolations- und Immunostaining-Verfahrens sind in dieser Abbildung zusammengefasst. Abkürzungen: DMEM, Dulbecco's Modified Eagle's Medium; FBS, fötales Rinderserum; CEE, Hühnerembryo-Extrakt; TA, Tibialis anterior; EDL, extensor digitorum longus Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: EDL-Dissektion der Maus und Isolierung einzelner Myofiber. (A) Die Haut des Hinterbeins der Maus wird entfernt und der Muskel, der die Faszie umgibt, wird weggezogen, um den TA-Muskel(Tibialis anterior)freizulegen. (B) Der TA-Muskel wird entfernt, um den EDL-Muskel(Extensor digitorum longus)freizulegen, der durch den weißen Pfeil gekennzeichnet ist. (C) Der EDL-Muskel wird durch Schneiden seiner Sehnen seziert. (D) Zwei EDL-Muskeln werden kollagenaseverdaut. (E) Aussehen des kollagenaseverdauten Muskels mit sichtbaren einzelnen Myofibern, die sich vom Gewebekern lösen. (F) Große und kleine Pasteurpipette mit Mensur. (G) Die EDL-Muskeln (gekennzeichnet durch schwarze Pfeile) werden mit einer Pasteurpipette mit großer Bohrung physisch verreibung. (H) Einzelne intakte Myofiber sind dünn und glänzend und können individuell für Kultur und Analyse gesammelt werden. (I) Hyperunternehmer und tote Myofiber sind für Kultur und Analyse ungeeignet. Die mikroskopischen Aufnahmen von 2H und 2I wurden mit einem Mikroskop mit einem N-Achroplan 5x Objektiv aufgenommen. Maßstabsbalken sind 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Mikroskopische Aufnahme eines ganzen einzelnen Myofibers mit seinen zugehörigen MuSCs. Einzelne Myofiber aus EDL von jungen C57BL/6-Mäusen wurden präpariert und nach Isolierung (0 h) PFA-fixiert. (A) Pax7- und DAPI-Immunfluoreszenzfärbung identifiziert Myofiber-assoziierte Muskelstammzellen (MuSCs, markiert durch Pfeile). Das mikroskopische Bild wurde mit der Kachel- und Z-Stack-Funktion eines Mikroskops aufgenommen, das mit einem Plan-Apochromat 40x Ölobjektiv ausgestattet ist. Der Maßstabsbalken beträgt 200 μm. (B) Vergrößerung von (A) zeigt die Myonukleien, einen Pax7-positiven Kern und das hell-dunkle Muster von myofibrillären Strukturen im Hellfeld. Der Maßstabsbalken beträgt 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Immunfluoreszenzbilder der MuSC-Aktivierung und myogenen Progression während der einzelnen Myofiberkultur. Muskelstammzellen (MuSCs) aus frisch isolierten Myofibern (0 h) stellen einen homöostatischen Zustand nahe der In-vivo-Ruheerscheinung dar, der durch die Expression von Pax7 und eine fehlende MyoD-Expression gekennzeichnet ist. Während der einzelnen Myofiberkultur regulieren die meisten MuSCs MyoD hoch und treten wieder in den Zellzyklus ein, um sich zu teilen und zu vermehren (42 h). Nach 72 h Kultur kann das MuSC-Schicksal anhand der myogenen Markerexpression unterschieden werden. Zellen mit nur Pax7-Expression erneuern sich selbst (roter Pfeil), während pax7 und MyoD doppelt positive Zellen (roter/grüner Pfeil) sich weiter vermehren. MyoD nur positive Zellen (grüner Pfeil) haben sich zur myogenen Differenzierung verpflichtet. Die mikroskopischen Aufnahmen wurden mit einem Mikroskop mit einem Plan-Apochromat 20x Objektiv (0 h, 42 h) oder einem LD Plan-Neofluar 40x Objektiv (72 h) aufgenommen. Maßstabsbalken sind 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Fluoreszierende siRNA-Transfektion von MuSCs und Aufnahmeanalyse. EDL-Einzelmyofasern wurden hergestellt und mit fluoreszierend markierter siRNA (siGLO) nach den schritten dieses Protokolls transfiziert. (A) Zytoplasmatische Akkumulation von siGLO-Granula spezifisch in einer Pax7-positiven Muskelstammzelle (MuSC) auf einem einzelnen Myofiber bei 30 h Kultur. Das mikroskopische Bild wurde mit der Z-Stack- und Apotom-Funktion eines Mikroskops mit einem Plan-Apochromat 100x Ölobjektiv aufgenommen. Skalenbalken sind 5 μm. (B) Quantifizierung der siRNA-Aufnahme durch Pax7-positive Muskelstammzellen bei 24 oder 30 h Kultur. (C) Anzahl der Pax7-positiven Zellen pro einzelnem Myofiber im Vergleich zu nicht transfizierten und transfizierten Zuständen nach 24 oder 30 Stunden Kultur. Die Daten werden als Mittelwert mit einer Standardabweichung von n = 4 Mäusen dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Hier wird eine Methode vorgestellt, um die Rolle eines bestimmten Gens in MuSCs mit einem in vitro Ansatz funktionell zu untersuchen. Wichtig ist, dass in dem hier beschriebenen System die MuSCs unter Bedingungen kultiviert werden, die der In-vivo-Situation so weit wie möglich ähneln und die meisten Wechselwirkungen der MuSCs mit ihrer Nische erhalten. Dies wird erreicht, indem isolierte Myofiber mit ihren benachbarten MuSCs unter schwimmenden Bedingungen und aufeinanderfolgender siRNA-Transfektion kultiviert werden. Die Verfahren der Myofiberisolierung, siRNA-Transfektion und Untersuchung von MuSC-Populationen während 72 h Kultur durch Immunfluoreszenzanalysen werden beschrieben. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass rund 74% aller MuSCs nach 30 h Kultur mit einer fluoreszenzmarkierten Kontroll-siRNA transfiziert wurden.

Besondere Aufmerksamkeit sollte auf die sorgfältige Dissektion des EDL-Muskels gerichtet werden, da ausgedehntes Dehnen, Kneifen oder Quetschen zu einer Kontraktion und einem anschließenden Tod der Myofiber führt. Darüber hinaus ist es wichtig, Cluster von MuSCs aus mindestens 20 verschiedenen Myofibern pro Replikat pro Bedingung zu untersuchen. Dies ist notwendig, da die MuSC-Zahlen und -Eigenschaften aufgrund der Existenz von MuSC-Subpopulationen variieren. Bei der Untersuchung der Wirkung einer spezifischen siRNA auf MuSCs unter Verwendung der Floating-Myofiber-Kulturmethode sollte ein Vergleich der Erkrankung mit der Ziel-siRNA mit der Nicht-Targeting-Kontrolle innerhalb derselben Maus und desselben Muskels durchgeführt werden. Dies wird empfohlen, um mausspezifische Unterschiede zu vermeiden, die Effekte der siRNA abdecken oder verstärken könnten. Die Knockdown-Effizienz kann durch Immunfluoreszenzanalysen mit Antikörpern bestimmt werden, die gegen das Zielgen gerichtet sind, wobei einzelne Myofiber mit ihren benachbarten MuSCs verwendet werden. Wenn dies keine Option ist, kann man die siRNA-Knockdown-Effizienz in primären Myoblasten testen, gefolgt von quantitativen RT-PCR- oder Immunoblot-Analysen. Die Effizienz der siRNA sollte bestimmt werden, bevor die Wirkung der siRNA auf MuSCs auf einzelne Myofiber analysiert wird. Die Verwendung eines intelligenten Pools, der aus 4 verschiedenen siRNAs im Vergleich zu einem einzigen besteht, erhöht die Knockdown-Effizienz, erhöht aber auch das Risiko eines unspezifischen Targetings. Eine nicht-zielgerichtete siRNA sollte als Kontrolle verwendet werden. Um die Transfektionseffizienz direkt zu überwachen, kann man eine fluoreszenzmarkierte Non-Targeting-siRNA verwenden, wie hier durchgeführt. Der Zeitpunkt für die Transfektion mit der siRNA liegt etwa 4 Stunden nach der Isolierung, ein Zeitpunkt, an dem die die MuSCs umgebende Basallamina bereits für die siRNA durchlässig ist. Wenn die Wirkung einer spezifischen siRNA auf MuSCs nach 72 oder 96 h untersucht werden sollte, wird empfohlen, eine zweite siRNA-Transfektion nach 24 h oder 48 h durchzuführen, um eine hohe Knockdown-Effizienz aufrechtzuerhalten.

Der myofiber culture assay weist vielfältige Vorteile gegenüber der Untersuchung von MuSCs mit herkömmlichen Zellkulturmethoden auf. MuSCs bleiben während des gesamten Isolationsprozesses an den Myofibern haften und bewahren so die entscheidende Wechselwirkung des MuSC mit seiner^{Nische 19,23,24,25}. Die erhaltene Interaktion von MuSCs mit dem Myofiber ist eine Voraussetzung für die Untersuchung nischenabhängiger Effekte auf die MuSC-Funktionalität, die in herkömmlichen 2D-Myoblastenkulturen nicht rekapituliert werden können. Zum Beispiel zeigen MuSCs während des Alterns eine beeinträchtigte myogene Kapazität, was zu einer verminderten Effizienz zur Regeneration von Muskelgewebe nach einer Schädigung führt^20,26. Diese Wertminderung ist zumindest teilweise auf Veränderungen in der MuSC-Nische, insbesondere auf Veränderungen in der ECM-Zusammensetzung^27,28, zurückzuführen. Das Myofiber-Kulturprotokoll ermöglicht das Studium und die Interferenz mit diesen abweichenden Nischenänderungen.

Im Gegensatz zu der hier beschriebenen Methode beinhaltet die Aufreinigung von MuSCs durch Immunmarkierungs- und -sortiertechniken wie FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) oder MACS (Magnetic Cell Sorting) die Entfernung der MuSCs aus ihrer Nische. Interessanterweise verlieren 2D-Kulturen isolierter MuSCs aus gealterten Muskeln ihre extrinsischen Hinweise und verhalten sich ähnlich wie MuSCs, die aus jungen Muskeln isoliert wurden, wodurch die In-vivo-Situation nicht angemessen rekapituliert wird²⁹. Weiterhin führt die vollständige Dissoziation des Muskelgewebes und die Markierung von MuSCs mit Oberflächenmarkern zu transkriptomischen Veränderungen und Aktivierung der Zellen^30,31,32. Ein weiterer Vorteil des myofiber-Kultursystems ist die Möglichkeit, die MuSC-Funktionalität auf verschiedenen Ebenen zu stören. Die Manipulation von MuSCs auf kultivierten Myofibern kann effektiv durch siRNA-vermittelten Gen-Knockdown erreicht werden, wie hier im Detail beschrieben. Ebenso ist die Anwendung chemischer Verbindungen oder die Abgabe von rekombinanten Proteinen sehr effektiv, um die Stammzellwege zu stören^20,28. Weiterhin erlauben retro- oder lentivirale Expressionsvektoren die Einführung exogener Gene, d.h. konstitutiver aktiver Mutanten³³. Zusätzlich kann der Einfluss extrinsischer Faktoren auf die MuSC-Funktionalität in dem hier beschriebenen System erforscht werden, z.B. können die Kulturbedingungen mit Überständen aus verschiedenen physiologischen oder pathologischen Quellen ergänzt werden, um verschiedene Zustände wie Krebskachexie^34,35zu modellieren.

Eine Einschränkung der hier beschriebenen Methode ist die Tatsache, dass das einzelne Myofiberkultursystem den Einfluss aller systemischen Faktoren oder den Einfluss anderer Zelltypen auf MuSCs nicht vollständig rekapitulieren kann. Auch die Zeit, in der die Myofiber in Kultur lebensfähig gehalten werden können, ist begrenzt und daher konzentriert sich die Untersuchung von MuSC-bezogenen Prozessen auf frühe Ereignisse wie Aktivierung und myogenes Engagement. Weiterhin ist die Untersuchung der MuSC-Interaktion mit anderen Nischenzellen wie Immunzellen oder fibro-adipogenen Vorläuferzellen nicht möglich. Um systemische Effekte auf die MuSC-Funktionalität zu untersuchen, kann man entweder Muskelverletzungsexperimente mit anschließender Analyse der Muskelregeneration in vivo durchführen oder Transplantationsexperimente^{durchführen 36,37}.

Zusammengenommen bietet das Myofiber-Isolations- und Kulturprotokoll eine große Chance für genetische oder mechanistische Studien an adulten MuSCs ohne die Notwendigkeit transgener Mausmodelle und kann möglicherweise Tierversuche reduzieren.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 2b	ThermoScientific	A-21141	use 1:1000 for IF
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1	ThermoScientific	A-21123	use 1:1000 for IF
chicken embryo extract	Seralab	CE-650-J	chicken embryo extract containing growth factors etc.
collagenase type 1	Sigma	C0130
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5 g/l glucose and sodium pyruvate)	GibCo	41966029	cell culture medium
fetal bovine serum	Gibco	10270-106	fetal bovine serum
horse serum	Gibco	26050-088
Lipofectamine RNAiMax	ThermoScientific	13778150	transfection reagent
MyoD antibody clone G-1	Santa Cruz	sc-377460	dilute 1:200 for IF
Pax7 antibody	DSHB	PAX7	use undiluted
siGLO Red Transfection Indicator	horizon discovery	D-001630-02-05	non targeting siRNA