Nachweis von Glykosaminoglykanen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Silberfärbung

Zusammenfassung

Dieser Bericht beschreibt Techniken zur Isolierung und Reinigung von sulfatierten Glykosaminoglykanen (GAGs) aus biologischen Proben und einen Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Ansatz, um ihre Größe anzunähern. GAGs tragen zur Gewebestruktur bei und beeinflussen Signalprozesse durch elektrostatische Interaktion mit Proteinen. Die GAG-Polymerlänge trägt zu ihrer Bindungsaffinität für verwandte Liganden bei.

Zusammenfassung

Sulfatierte Glykosaminoglykane (GAGs) wie Heparansulfat (HS) und Chondroitinsulfat (CS) sind in lebenden Organismen allgegenwärtig und spielen eine entscheidende Rolle in einer Vielzahl grundlegender biologischer Strukturen und Prozesse. Als Polymere existieren GAGs als polydisperse Mischung, die Polysaccharidketten enthält, die von 4000 Da bis weit über 40.000 Da reichen können. Innerhalb dieser Ketten existieren Domänen der Sulfatierung, die ein Muster negativer Ladung verleihen, das die Interaktion mit positiv geladenen Rückständen verwandter Proteinliganden erleichtert. Sulfatierte Domänen von GAGs müssen eine ausreichende Länge haben, um diese elektrostatischen Wechselwirkungen zu ermöglichen. Um die Funktion von GAGs in biologischen Geweben zu verstehen, muss der Prüfer in der Lage sein, die Größe von GAGs zu isolieren, zu reinigen und zu messen. Dieser Bericht beschreibt eine praktische und vielseitige Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese-basierte Technik, die genutzt werden kann, um relativ kleine Größenunterschiede zwischen GAGs zu lösen, die aus einer Vielzahl von biologischen Gewebetypen isoliert wurden.

Einleitung

Glykosaminoglykane (GAGs) sind eine vielfältige Familie linearer Polysaccharide, die ein allgegenwärtiges Element in lebenden Organismen sind und zu vielen grundlegenden physiologischen Prozessen beitragen¹. GAGs wie Heparansulfat (HS) und Chondroitinsulfat (CS) können an verschiedenen Positionen entlang der Polysaccharidkette sulfatiert werden, wodurch geografische Domänen negativer Ladung entstehen. Diese GAGs, wenn sie an Zelloberflächenproteine gebunden sind, die als Proteoglykane bekannt sind, projizieren in den extrazellulären Raum und binden an verwandte Liganden, was die Regulation sowohl der cis- (Liganden, der an dieselbe Zelle gebund....

Protokoll

Alle biologischen Proben, die in diesem Protokoll analysiert wurden, wurden von Mäusen gemäß Protokollen gewonnen, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Colorado genehmigt wurden.

1. Heparansulfat-Isolierung

1. Delipidierung von Gewebeproben
   HINWEIS: Die Delipidierung ist ein optionaler Schritt für fettreiche Gewebe.
   1. Stellen Sie eine 1:1-Mischung aus Methanol und Dichlormethan zusammen. Bereiten Sie etwa 500 μL pro Probe vor; größere Gewebestücke können bis zu 1 ml benötigen.
   2. Legen Sie jede Gewebeprobe in einen kleinen Glasbehälter mit einem Deckel zur Entpissenbi....

Ergebnisse

Alcianblau wird verwendet, um sulfatierte GAGs ¹⁰zu färben; Dieses Signal wird durch die Verwendung eines nachfolgenden Silberflecks ¹¹verstärkt. Abbildung 1 zeigt eine visuelle Demonstration des Entwicklungsprozesses der Silberfärbung. Wie gezeigt, wird das alcianblaue Signal, das durch Elektrophorese getrennte GAGs darstellt, verstärkt, wenn das entwicklungsende Mittel in das Polyacrylamidgel eindringt. Typischerweise reduziert der Entwic.......

Diskussion

GAGs spielen eine zentrale Rolle in vielen verschiedenen biologischen Prozessen. Eine der Hauptfunktionen von sulfatierten GAGs (wie HS und CS) besteht darin, mit Liganden zu interagieren und an sie zu binden, was die nachgeschalteten Signalfunktionen verändern kann. Eine wichtige Determinante der GAG-Bindungsaffinität zu verwandten Liganden ist die Länge der GAG-Polymerkette ^8,9,14. Aus diesem Grund ist es wichtig, dass Fors.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge	thermoFisher Scientific	13-100-675	Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate
Acrylamide (solid)	thermoFisher Scientific	BP170-100	Electrophoresis grade
Actinase E	Sigma Aldrich	P5147	Protease mix from S. griseus
Alcian Blue 8GX (solid)	thermoFisher Scientific	AC400460100
Ammonium acetate (solid)	thermoFisher Scientific	A639-500	Molecular biology grade
Ammonium hydroxide (liquid)	thermoFisher Scientific	A669S-500	certified ACS
Ammonium persulfate (solid)	thermoFisher Scientific	BP179-25	electrophoresis grade
Barnstead GenPure Pro Water Purification System	ThermoFisher Scientific	10-451-217PKG	Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute
Boric acid (solid)	thermoFisher Scientific	A73-500	Molecular biology grade
Bromphenol blue (solid)	thermoFisher Scientific	B392-5
Calcium acetate (solid)	ThermoFisher Scientific	18-609-432	Molecular biology grade
Calcium chloride (solid)	ThermoFisher Scientific	AC349610250	Molecular biology grade
CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)	ThermoFisher Scientific	28299
Chondroitinase ABC	Sigma Aldrich	C3667
Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells)	Bio-Rad	3459901	Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice
Criterion PAGE Cell system (cell and power supply)	Bio-Rad	1656019	any comparable vertical gel PAGE system will work)
Dichloromethane (liquid)	thermoFisher Scientific	AC610931000	certified ACS
EDTA disodium salt (solid)	thermoFisher Scientific	02-002-786	Molecular biology grade
Glacial acetic acid (liquid)	thermoFisher Scientific	A35-500	Certified ACS
Glycine (solid)	thermoFisher Scientific	G48-500	Electrophoresis grade
Heparanase I/III	Sigma Aldrich	H3917	From Flavobacterium heparinum
Heparin derived decasaccharide (dp10)	galen scientific	HO10
Heparin derived hexasaccharde (dp6)	Galen scientific	HO06
Heparin derived oligosaccharide (dp20)	galen scientific	HO20
Hydrochloric acid (liquid)	thermoFisher Scientific	A466-250
Lyophilizer	Labconco	7752020	Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator
Methanol (liquid)	thermoFisher Scientific	A412-500	Certified ACS
Molecular Imager Gel Doc XR System	Bio-Rad	170-8170	Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute
N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid)	thermoFisher Scientific	BP171-25	Electrophoresis grade
Phenol red (solid)	thermoFisher Scientific	P74-10	Free acid
Q Mini H Ion Exchange Column	Vivapure	VS-IX01QH24	Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11
Silver nitrate (solid)	thermoFisher Scientific	S181-25	certified ACS
Sodium Acetate (solid)	ThermoFisher Scientific	S210-500	Molecular biology grade
Sodium chloride (solid)	thermoFisher Scientific	S271-500	Molecular biology grade
Sodium hydroxide (solid)	thermoFisher Scientific	S392-212
Sucrose (solid)	thermoFisher Scientific	BP220-1	Molecular biology grade
TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine)	thermoFisher Scientific	BP150-20	Electrophoresis grade
Tris base (solid)	thermoFisher Scientific	BP152-500	Molecular biology grade
Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff	Amicon	UFC500324	Larger volume filter units may be used, depending on sample size.
Urea (solid)	ThermoFisher Scientific	29700
Vacufuge Plus	Eppendorf	22820001	Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer
Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume	thermoFisher Scientific	569-0020	Alternative volumes and filter materials acceptable