Anwendung von Ultraschall- und Scherwellen-Elastographie-Bildgebung in einem Rattenmodell von NAFLD / NASH

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung einer verbesserten Ultraschalltechnik zur nicht-invasiven Beobachtung und Quantifizierung von Lebergewebeveränderungen in Nagetiermodellen der nichtalkoholischen Fettlebererkrankung.

Zusammenfassung

Nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) ist eine Erkrankung im Spektrum der nichtalkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD), die durch Leberfettansammlung (Steatose) und Entzündungen gekennzeichnet ist, die zu Fibrose führen. Präklinische Modelle, die humanes NASH/NAFLD eng rekapitulieren, sind für die Arzneimittelentwicklung unerlässlich. Während die Leberbiopsie derzeit der Goldstandard für die Messung der NAFLD / NASH-Progression und -Diagnose in der Klinik ist, ist im präklinischen Bereich entweder die Entnahme ganzer Leberproben zu mehreren Zeitpunkten während einer Studie oder eine Leberbiopsie für die histologische Analyse erforderlich, um das Krankheitsstadium zu beurteilen.

Die Durchführung einer Leberbiopsie während der Studie ist ein invasives und arbeitsintensives Verfahren, und das Sammeln von Leberproben zur Beurteilung des Krankheitsniveaus erhöht die Anzahl der für eine Studie benötigten Versuchstiere. Daher besteht ein Bedarf an einem zuverlässigen, übersetzbaren, nicht-invasiven bildgebenden Biomarker, um NASH/ NAFLD in diesen präklinischen Modellen nachzuweisen. Nicht-invasive ultraschallbasierte B-Mode-Bilder und Shear Wave Elastography (SWE) können verwendet werden, um Steatose sowie Leberfibrose zu messen. Um den Nutzen von SWE in präklinischen Nagetiermodellen von NASH zu bewerten, wurden die Tiere auf eine Pro-NASH-Diät gesetzt und einer nicht-invasiven Ultraschall-B-Mode- und Scherwellen-Elastographie-Bildgebung unterzogen, um den hepatorenalen (HR) Index und die Leberelastizität zu messen und das Fortschreiten sowohl der Leberfettansammlung als auch der Gewebesteifigkeit zu mehreren Zeitpunkten im Laufe einer bestimmten NAFLD / NASH-Studie zu messen.

Der HR-Index und die Elastizitätszahlen wurden mit histologischen Markern für Steatose und Fibrose verglichen. Die Ergebnisse zeigten eine starke Korrelation zwischen dem HR-Index und dem Prozentsatz der Oil Red O (ORO) -Färbung sowie zwischen Elastizität und Picro-Sirius Red (PSR) -Färbung der Leber. Die starke Korrelation zwischen klassischen Ex-vivo-Methoden und In-vivo-Bildgebungsergebnissen liefert Hinweise darauf, dass Scherwellen-Elastographie/ Ultraschall-basierte Bildgebung verwendet werden kann, um den Krankheitsphänotyp und das Fortschreiten in einem präklinischen Modell von NAFLD / NASH zu beurteilen.

Einleitung

Die nichtalkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) ist eine Stoffwechselerkrankung, die durch eine übermäßige Ansammlung von Fett in der Leber gekennzeichnet ist und sich schnell zu einer weltweit führenden Lebererkrankung mit einer kürzlich gemeldeten globalen Prävalenz von 25%^{entwickelt 1}. Die nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) ist ein fortgeschritteneres Stadium des NAFLD-Spektrums, das durch überschüssiges Leberfett mit fortschreitenden Zellschäden, Entzündungen und Fibrosen gekennzeichnet ist. Diese Beschwerden sind oft still, unentdeckt durch Blutuntersuchungen oder Routineuntersuchungen, bis bereits erhebliche Schäden an der Leber eines Patienten aufgetreten sind. Derzeit ist der Goldstandard für die Diagnose von NASH bei Patienten die histologische Untersuchung von Leberbiopsieproben aus Patienten. In ähnlicher Weise verlassen sich präklinische Forscher, die daran arbeiten, die Pathogenese von NASH / NAFLD sowie die Arzneimittelentwicklungsindustrie zu verstehen, auf die In-vivo-Keilbiopsie von Leberproben oder die terminale Euthanasie von Satellitenkohorten für die Histologie, um Steatose, Entzündung und Fibrose zu messen.

Zum Beispiel war die Leberkeilbiopsie eine Standardtechnik zur Beurteilung von Steatohepatitis und Fibrose unter Verwendung des GUBRA NASH^{Modells 2}. Die Leberkeilbiopsiemethode ist invasiv und mühsam bei Kleintieren³. Die Verwendung der Keilleberbiopsie in der Mitte einer Studie stellt eine zusätzliche experimentelle Variable in einem Krankheitsmodell dar, die oft die Anzahl der benötigten Tiere erhöht. Vor diesem Hintergrund erweisen sich nicht-invasive bildgebende Verfahren, mit denen Steatose und Fibrose in NASH/NAFLD-Tiermodellen zu einem frühen Zeitpunkt zuverlässig beurteilt werden können, als wertvoll. Die Scherwellenelastographie (SWE) ist eine ultraschallbasierte Methode zur Messung der Elastizität von Weichteilen. Die Technik misst die Ausbreitung von Scherwellen, die durch Überschall-Ultraschallpulse erzeugt werden, die auf ein Gewebeziel gerichtet sind, und berechnet dann einen Wert namens E-Modul⁴. Die Geschwindigkeit der Scherwelle ist proportional zum Grad der Gewebesteifigkeit.

Abbildung 1 und Abbildung 2 zeigen den Aufbau des Bildgebungsbereichs und das SWE-Instrument. Das SWE-Gerät ist eine einzelne, auf Rädern gesteuerte Einheit mit zwei Bildschirmen und einem Bedienfeld, wie in Abbildung 2A dargestellt. Der obere Monitor (Abbildung 2B) fungiert als Computermonitor und zeigt Bilder und Patientenverzeichnisse an. Das Bedienfeld (Abbildung 2C) besteht aus einer Reihe von Tasten und Zifferblättern, die allgemeine Aspekte der Bilderfassung steuern: Bildschirm einfrieren, Bilder speichern, von einem Modus in einen anderen wechseln. Der untere Bildschirm (Abbildung 2D) ist ein Touchscreen mit zusätzlichen Steuerelementen zum Ändern von Einstellungen und fungiert als Tastatur, um Daten nach Bedarf einzugeben. Das Instrument ist mit einem Stift ausgestattet, der auf Wunsch auf dem Touchscreen verwendet werden kann. Ultraschallsonden werden an der unteren Frontplatte des Geräts befestigt. Für die B-Mode- und SWE-Bildgebung bei Nagetieren wurde der superlineare 6- bis 20-MHz-Wandler verwendet. Diese Fähigkeit, die Gewebesteifigkeit nichtinvasiv zu messen, macht SWE zu einem wertvollen Werkzeug für die Identifizierung und das Staging von Leberfibrose⁵ bei NASH-Patienten, wodurch der Bedarf an invasiveren Methoden verringert wird. SWE wurde in der Tat verwendet, um Leberfibrose bei Patienten zu messen und ist eine von der FDA zugelassene Methode zur Bewertung von Fibrose in der Klinik⁶. Die Verwendung von SWE zur Überwachung der NASH-Progression in Tiermodellen der Krankheit würde ein translationales Werkzeug für die Entwicklung von Behandlungen bieten und gleichzeitig das Wohlergehen der Tiere durch die Reduzierung der Anzahl der Tiersubstanen und die Verfeinerung von In-vivo-Verfahren verbessern, um Schmerzen und Ängste zu minimieren.

Die SWE-Bildgebung bei menschlichen Patienten verwendet einen niederfrequenten Ultraschallwandler⁴, der für kleine Tiere nicht ideal ist. Insbesondere wurden Hochfrequenz-SWE-Techniken verwendet, um die Wirksamkeit der Acetyl-CoA-Carboxylase-Hemmung auf die Pathogenese von NASH in einem Rattenmodell⁷zu bewerten, und der Nutzen dieser Technik wurde in Tetrachlorkohlenstoff-Rattenmodellen der Leberfibrose mit erfolgreichen Ergebnissen im Vergleich zu herkömmlichen histologischen METAVIR-Scoring-Methoden beschrieben⁸. In der vorhandenen Literatur fehlen jedoch detaillierte technische und methodische Informationen zur Anwendung der SWE-Bildgebung in präklinischen NASH-Modellen. Wie oben beschrieben, ist die Lebersteatose eines der Hauptmerkmale der NAFLD / NASH-Erkrankung und eine wichtige Phase, in der eine Intervention in Betracht gezogen werden kann. Daher ist die Beurteilung der Leberfettansammlung mit einer bildgebenden Modalität genauso wichtig wie die Beurteilung der Leberfibrose in präklinischen Modellen von NASH / NAFLD.

Eine Ultraschalltechnik, die als HR-Index bekannt ist, ein Verhältnis der Gewebehelligkeit der Leber im Vergleich zu der der Nierenrinde, wurde in der Klinik als Ersatzmarker für Steatose verwendet^9,10. Dieser Ansatz wurde jedoch in präklinischen Tiermodellen von NAFLD/NASH nicht umfassend angewendet. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Messung der Elastizität sowie des HR-Index als Ersatzmarker für Leberfibrose bzw. Steatose in einem Cholinmangel-, fettreichen Diät- (CDAHFD) Rattenmodell von NAFLD / NASH. Dieses Modell induziert schnelle Steatose, Leberentzündung und Fibrose, die innerhalb von 6 Wochen bei Mäusen messbar ist¹¹. Es hat sich gezeigt, dass die Zugabe von Cholesterin (1%) zu dieser Diät die Fibrogenese bei Ratten^{fördert 12}, was dieses Modell zu einem geeigneten Kandidaten für Validierungsstudien mit Scherwellenbildgebung macht. Insgesamt kann diese Bildgebungstechnologie auch auf eine Vielzahl von NASH-Modellen / Diäten angewendet werden, bei denen Steatose und / oder Fibrose ein Endpunkt von Interesse ist.

Protokoll

Alle tierbehafteten Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Pfizer überprüft und genehmigt und in einer aaaLAC (Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) International akkreditierten Einrichtung durchgeführt.

1. Krankheitsinduktion

1. Verwenden Sie männliche Wister Han Ratten (150-175 g; ~ 6-7 Wochen alt; insgesamt 40 Ratten), die frei von bekannten Ratten adventitiellen Krankheitserregern sind. Die Ratten paarweise in einzeln belüfteter Käfig mit Papiereinstreu unterbringen (siehe Materialtabelle)und bei 22 ± 1 °C, 40-70% relativer Luftfeuchtigkeit mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12:12 h halten.
2. Setzen Sie die Ratten mit einem Gewicht von 150-175 g (~ 6-7 Wochen alt) auf eine cholinarme, fettreiche Diät mit 1% Cholesterin (n = 20) oder einem Standard-Labor-Nagetier-Chow (n = 20), abhängig vom Studiendesign.
   HINWEIS: In dieser Studie wurden insgesamt 40 Ratten mit 20 Tieren pro Gruppe aufgenommen. Am Ende der^6. Woche wurde die Hälfte der Kohorte aus jeder Gruppe für die histologische Analyse von Leberproben während der Studie nekropsiert. Somit betrug die Stichprobengröße 10 Tiere pro Gruppe für die Zeit^{der 9.} und^12. Woche.

2. Geräteeinrichtung

1. Richten Sie den Bildgebungsbereich wie folgt ein: Schließen Sie eine erwärmte Oberfläche ein, um das Tier während der Bildgebung warm zu halten (c in Abbildung 1),und einen gesicherten Anästhesie-Nasenkegel, um eine Inhalationsanästhesie zu liefern, um eine Anästhesieebene während des gesamten Verfahrens aufrechtzuerhalten (b in Abbildung 1).
2. Verwenden Sie einen Ultraschallsondenhalter, um das Bewegen der Ultraschallsonde an die gewünschte Stelle zu erleichtern und zu verhindern, dass die Sonde auf dem Tier ruht.
   1. Verwenden Sie erwärmtes Ultraschallgel auf der Haut, wo das Ultraschallbild aufgenommen wird.
   2. Behalten Sie während des gesamten Verfahrens die folgenden Einstellungen bei, die auf dem Touchscreen angepasst werden können: Akustische Leistung 0,0 dB; Tissue Tuner 1540 m/s; Dynamikbereich 60 dB; Elastizitätsbereich (für SWE-Modus) < 30 kPa.
3. Befestigen Sie die Ultraschallsonde am Schienensystem in der speziellen Halterung (a in Abbildung 1).
4. Schalten Sie das Instrument ein und lassen Sie es hochfahren. Sobald der Monitor eingeschaltet ist, notieren Sie sich das B-Modus-Bild mit den Details des angeschlossenen Wandlers.

3. Themenvorbereitung

1. Stellen Sie sicher, dass die Tiere mindestens 4 Stunden vor dem bildgebenden Verfahren gefastet werden, um zu verhindern, dass der Darminhalt die Bildaufnahme beeinträchtigt.
   1. Nach mindestens 4 Stunden Fasten eine Ratte in eine Isofluran-Anästhesie-Induktionskammer legen, bis ein geeignetes Anästhesieniveau erreicht ist, das durch keine Reaktion auf Zehenklemmen bestätigt wird. Setzen Sie die Tiere 3-5% Isofluran für 3-5 minuten aus, um eine Anästhesie zu induzieren.
   2. Für die Erhaltungsanästhesie halten Sie die Tiere während der Bildaufnahme unter 2-3% Isofluran. Tragen Sie eine Augensalbe auf, um das Auge vor dem Austrocknen während der Anästhesie zu schützen.
2. Sobald die Anästhesie erreicht ist, entfernen Sie ein Tier aus der Induktionskammer und legen Sie es auf eine warme, heiße Wasserzirkulationsdecke. Legen Sie einen Anästhesie-Nasenkegel über die Schnauze und rasieren Sie das Tier auf der rechten Seite, vom Brustkorb bis zum Becken. Verwenden Sie chemische Enthaarungscreme, um alle verbleibenden Haare in diesem Bereich zu entfernen.
3. Sobald die Haare entfernt wurden, legen Sie ein Tier in den linken seitlichen Liegeplatz mit oberen Pfoten, die über dem Kopf auf eine warme Bildgebungsplattform geklebt sind (Abbildung 3A).
4. Drücken Sie die Patiententaste auf dem Bedienfeld des Instruments und identifizieren Sie das Subjekt entsprechend dem Studiendesign.
   1. Öffnen Sie die Tastaturfunktion auf dem Instrument, indem Sie auf das Symbol auf dem Touchscreen tippen. Geben Sie die Namen wie gewünscht ein.
   2. Tippen Sie auf Beenden, um den Bildschirm mit dem Patientennamen zu verlassen. Beachten Sie, dass der B-Modus auf dem Monitor erneut geöffnet wird.

4. Bilderfassung zur hepato-renalen (HR) Indexmessung

1. Tragen Sie eine kleine Menge erwärmtes Ultraschallgel auf die enthaarte Hautregion des Tieres auf.
2. Bewegen Sie die Ultraschallsonde, um den gelbedeckten Bereich des Probanden zu berühren (Abbildung 3B). Sobald ein Live-B-Modus-Bild der inneren Organe des Probanden auf dem Monitor erscheint, bewegen Sie die Ultraschallsonde in den Bereich etwas oberhalb der Hüfte, nur parallel zu den Lendenwirbeln (sagittale Ebene).
3. Lokalisieren Sie mithilfe der B-Modus-Anzeige auf dem Monitor die rechte Niere, indem Sie die große Nierenarterie und die Trennung von Kortex/Medulla identifizieren (Abbildung 4A). Beobachten Sie außerdem einen Teil der Leber in einer einzigen Ebene des Bildes.
   1. Stellen Sie sicher, dass wenig bis gar keine Bildartefakte wie Schatten und Luftblasen vorhanden sind.
4. Messen Sie ein B-Modus-Verhältnis, um den HR-Index zu erhalten.
   1. Stellen Sie sicher, dass sich sowohl die Nierenrinde als auch das Leberparenchym in derselben Fokusebene befinden. Passen Sie bei Bedarf den Fokus und die Verstärkungssteuerung an, um ein klares Bild zu erhalten.
      1. Stellen Sie den Fokus ein, indem Sie den Fokusknopf auf dem Bedienfeld drehen. Passen Sie die Verstärkung an, indem Sie die Auto TGC-Taste einmal drücken.
   2. Drücken Sie die Freeze-Taste auf dem Bedienfeld. Stellen Sie sicher, dass sich das Tier beim Einfrieren des Bildschirms zwischen den Atemzügen befindet, um verschwommene Bilder zu vermeiden.
   3. Sobald der Bildschirm eingefroren ist, tippen Sie auf dem Touchscreen auf Messwerkzeuge. Wählen Sie B-Mode Ratio, ein integriertes Werkzeug, das die relative Helligkeit eines Gewebes aus einem ausgewählten Bereich von Interesse misst. Erstellen Sie einen 2-mm-Kreis, um eine Region von Interesse (ROI) auszuwählen. Passen Sie die Kreisgröße an, indem Sie einen Finger entlang der äußeren Kante des Trackballs auf dem Bedienfeld bewegen.
   4. Platzieren Sie den 2 mm Kreis auf dem Leberbild ROI, der sich rechts von der Niere befinden sollte. Identifizieren Sie Lebergewebe basierend auf seiner homogenen Echogenität und glatten Kontur.
   5. Sobald der Kreis an Ort und Stelle ist, drücken Sie die Taste Select (Auswählen) auf dem Bedienfeld, und beobachten Sie den neuen Kreis, der angezeigt wird.
   6. Passen Sie die Größe des neuen Kreises auf 2 mm an und platzieren Sie ihn auf dem Bild der Nierenrinde. Achten Sie darauf, die Tiefe der Kreise auf der Leber und der Nierenrinde gleich zu halten. Drücken Sie nach dem Setzen die Taste Select (Auswählen) auf dem Bedienfeld. Beachten Sie, dass das integrierte Systemtool den HR-Index als B-Modus-Verhältnis anzeigt.
   7. Klicken Sie auf Bild speichern, um das Bild zu speichern, und beobachten Sie die gespeicherten Bilder, die als Miniaturansichten auf der rechten Seite des Monitors angezeigt werden.
   8. Drücken Sie die Freeze-Taste auf dem Bedienfeld, um die Fixierung des Bildes zu aufheben und zu einem Live-B-Modus-Bild zurückzukehren.
5. Wiederholen Sie die Messung des B-Modus-Verhältnisses 3 Mal in verschiedenen Tiefen und Gewebeebenen. Berechnen Sie den Durchschnitt dieser drei B-Modus-Verhältnisse für jedes Tier und jeden Zeitpunkt.

5. Bilderfassung für Shear Wave Elastography

1. Bewegen Sie die Sonde quer in den rechten subkostalen Bereich, um die Leber im B-Modus zu lokalisieren. Lokalisieren Sie einen Bereich der Leber, der meist Parenchym ist und frei von großen Blutgefäßen wie Pfortader und Leberarterie ist. Sobald ein klarer Bereich der Leber gefunden wurde, erstellen Sie eine Scherelastizitätskarte des Gewebes, indem Sie die SWE-Taste auf dem Bedienfeld drücken.
2. Passen Sie die Größe und Position der SWE-Box unter der Leberkapsel in einem bereich an, der frei von Schatten ist. Identifizieren Sie die Kapsel als helle echogene Linie in der Nähe der Leberspitze.
3. Beachten Sie, dass die SWE-Box innerhalb von 5-10 s in eine Farbkarte übergeht. Sobald die Box voll und stabil ist, drücken Sie die Freeze-Taste auf dem Bedienfeld, wenn sich das Tier zwischen den Atemzügen befindet.
   HINWEIS: Die Mindestabdeckung der Box sollte 60-80% betragen, um die Elastizität der Leber genau zu beurteilen.
4. Tippen Sie auf dem Touchscreen auf QBox, ein integriertes Systemtool, das die Elastizität aus einem ROI auf der Scherwellenelastizitätskarte berechnet. Beobachten Sie den Kreis und das Datenfeld, die auf dem Monitor angezeigt werden. Passen Sie die Position der QBox an, indem Sie auf das Positionssymbol auf dem Touchscreen tippen, um das gewünschte Setup zu erhalten.
5. Stellen Sie die Größe des Kreises auf 3 mm ein, indem Sie einen Finger entlang der Außenkante des Trackballs auf dem Bedienfeld bewegen. Positionieren Sie den Kreis mit dem Trackball in einem schattenfreien Bereich mit gleichmäßiger Färbung (Abbildung 5A, B). Achten Sie darauf, bekannte Steifigkeitsbereiche wie Blutgefäße oder die Leberkapsel sowie Blutungen aus diesen Strukturen zu vermeiden.
6. Wenn ein geeigneter Bereich gefunden wurde, drücken Sie Bild speichern auf dem Bedienfeld, um das Bild zu speichern. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3 mal in verschiedenen Bereichen der Leber. Bewegen Sie die Sonde auf und ab oder seitlich auf dem Bauch, um SWE-kartierte Bilder aus verschiedenen Bereichen der Leber zu sammeln.
7. Sobald alle Bilder gesammelt wurden, drücken Sie auf dem Bedienfeld auf Prüfung beenden und notieren Sie sich den Patienteninformationsbildschirm, der auf dem Monitor angezeigt wird.
8. Entfernen Sie das Klebeband von den Pfoten des Tieres, wischen Sie überschüssiges Gel weg und entfernen Sie das Tier aus der Bildgebungsphase. Lassen Sie es sich von der Anästhesie in einem warmen, trockenen Käfig selbst erholen, bis es vollständig erholt ist. Überwachen Sie jedes Tier, um eine vollständige Genesung von der Anästhesie sicherzustellen, was durch seine Fähigkeit zur Aufrechterhaltung der sternalen Liege liege
9. Wiederholen Sie die Schritte in den Abschnitten 4-5 für jedes Tier in der zu bildenden Kohorte.

6. Bilddatenabruf und -analyse

1. Wenn Bilder für alle Tiere gesammelt wurden, schalten Sie die Anästhesie aus.
2. Um Bilddaten vom Gerät abzuziehen, drücken Sie die Taste Überprüfen auf dem Bedienfeld und beobachten Sie alle scans, die auf diesem Gerät ausgeführt werden und auf dem Monitor angezeigt werden. Suchen Sie nach den gewünschten Scans über das Suchfenster in der oberen Ecke des Bildschirms.
3. Wählen Sie alle für die Datenanalyse erforderlichen Scans aus, indem Sie das Kontrollkästchen neben dem Namen des Patienten über den Trackball und die Schaltfläche Auswählen aktivieren. Sobald alle erforderlichen Scans markiert sind, wählen Sie JPEGs exportieren auf dem Touchscreen aus. Exportieren Sie Daten auf ein Netzlaufwerk oder ein tragbares USB-Laufwerk (Universal Serial Bus). Suchen Sie die USB-Anschlüsse auf der Rückseite des Geräts.
4. Sobald die Dateien exportiert wurden, öffnen Sie einzelne JPG-Dateien jedes Scans auf einem Arbeitsstationscomputer. Beobachten Sie alle Daten auf der rechten Seite des Bildes: B-Modus-Verhältnis-Sammeln Sie die B-Verhältnis-Nummer; Q Box-Sammeln Sie den mittleren Elastizitätswert (kPa).
5. Geben Sie alle Daten in eine Tabellenkalkulation oder eine andere Datenbankverwaltungssoftware ein und führen Sie die gewünschten statistischen Analysen durch.

7. Histologische Analyse von Leberproben

1. Führen Sie am Ende der^6. Woche eine Nekropsie an der Hälfte der Kohorte aus jeder Gruppe durch, um die leberproben während der Studie histologisch zu analysieren. In ähnlicher Weise euthanasieren Sie den Rest der Kohorte von Tieren und sammeln Leberproben für die histologische Analyse zum Zeitpunkt der 12. Woche.
2. Für die ORO-Färbung leberabschnitte in 10% neutral gepuffertes Formalin fixieren und sie mit Saccharose kryokonservieren, wobei Mindestens über Nacht eine gekühlte 30% ige Saccharoselösung verwendet wird. Kryo-Einbetten der Abschnitte in eine optimale Schneidtemperatur-Mischung und Kryo-Schneiden sie auf geladene Dias, um sich auf die ORO-Färbung vorzubereiten.
3. Die Kryoschnitte für 2 min in 100% Propylenglykol geben, gefolgt von einer Inkubation über Nacht in 0,5% iger ORO-Lösung. Nach dem Entfernen aus der ORO-Lösung die Abschnitte in 85% Propylenglykol für 1 min differenzieren, in entionisiertem Wasser abspülen und 1 min lang mit Mayers Hämatoxylin-Lillie-Modifikation gegenbekommen.
   1. Legen Sie die Abdeckrlips mit einem wässrigen Montagemedium auf die Schienen und trocknen Sie sie bei Raumtemperatur.
4. Für PSR entparaffinisieren Sie formalinfixierte, paraffinierte Leberabschnittsobjektträger, legen Sie sie über Nacht in Bouin Fluid und färben Sie sie dann mit einem automatisierten Diafärbemittel gemäß dem Protokoll des Herstellers mit einigen optimierten Schritten (1% Phosphomolybdisäure für 5 min; 0,1% Sirius Red in gesättigter Pikrinsäure für 90 min; 2 x 30 s in 0,5% Essigsäure waschen). Dehydrieren Sie die Objektträger automatisch und montieren Sie sie dann mit einem permanenten Montagemedium.
5. Erfassen Sie Bilder der ORO- und PSR-gefärbten Dias mit dem digitalen Mikroskopiescanner bei 20-facher Vergrößerung, speichern Sie sie im SVS-Format und speichern Sie sie in der Diamanager-Bilddatenbank.
6. Analysieren Sie die Bilder mit benutzerdefinierten Algorithmen, die in einer digitalen Pathologiesoftware erstellt wurden. Wenden Sie digitale Pathologie-Softwareanwendungen mit Schwellenwertparametern einheitlich an, um den Bereich der Leberschnitte sowie die ORO- und PSR-gefärbten Bereiche zu identifizieren und zu quantifizieren. Exportieren Sie die Messungen in eine Tabelle für Flächenprozentsatzberechnungen.

8. Statistische Auswertung

1. Führen Sie eine statistische Analyse der Bildgebungsdaten mit Zwei-Wege-ANOVA durch, indem Sie den Mehrfachvergleichstest von Sidak verwenden, um den Unterschied zwischen Gruppen zu verschiedenen Zeitpunkten zu bewerten. Nehmen wir signifikante Unterschiede zwischen Gruppen für Wahrscheinlichkeitswerte p ≤ 0,001 an. Führen Sie außerdem eine Korrelation der bildgebenden Auswertungen mit histologischen Analysen durch.
2. Verwenden Sie nicht-parametrische Statistiken, um die histologischen Analyseergebnisse dieser Studie zu analysieren. Melden Sie die Gruppenwerte als Median ± Semi-Interquartilsbereich (sIQR). Nehmen wir signifikante Unterschiede zwischen Gruppen für Wahrscheinlichkeitswerte p ≤ 0,001 an. Verwenden Sie einen Mann-Whitney-Test, um die Menge an PSR- und ORO-histochemischer Färbung zwischen verschiedenen Gruppen zu vergleichen.

Ergebnisse

Ein Kennzeichen von Tieren, die mit CDAHFD gefüttert werden, ist die Steatose. Die Ansammlung von Fett in der Leber verändert die echogenen Eigenschaften des Gewebes, die quantifiziert werden können, indem die Helligkeit der Leber gemessen und auf die Helligkeit der Nierenrinde aus einem B-Mode-Bild normalisiert wird, das in derselben Ebene aufgenommen wurde. Der quantifizierte Wert wird als HR-Index ausgedrückt, der ein indirektes Maß für die Steatose ist. In Abbildung 4Azeigt ein rep...

Diskussion

Ultraschallbasierte Bildgebung, einschließlich SWE, kann ein unschätzbares Werkzeug für die longitudinale Beurteilung von Lebersteatose und Steifheit in präklinischen Modellen von NAFLD / NASH sein. Dieses Papier beschreibt detaillierte Methoden zur Erfassung hochwertiger B-Mode- und SWE-Bilder von Lebern zur Messung des HR-Index und der Elastizität mit einem CDAHFD-Diät-induzierten Rattenmodell von NASH. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse eine ausgezeichnete Korrelation des HR-Index und der Elastizität mit dem...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aixplorer	Supersonic Imagine		Shear Wave Elastography Instrument
Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer	Supersonic Imagine		Transducer for Shear Wave Elastography
Alpha-dri bedding			rat cages
Aperio AT2 scanner	Leica Biosystems		Digital Pathology Brightfield Scanner
Compac 6 Anesthesia System	VetEquip		Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however.
Manage Imager Database	Leica Biosystems		Digital Pathology
Mayer's Hematoxilin	Dako/Agilent		H&E Staining/Histology
Nair	Church & Dwight		Hair remover
Oil Red O solution	Poly Scientific		Lipid Staining/Histology
Picrosirius Red Stain (PSR)	Rowley Biochemical	F-357-2	Collagen Stain/Histology
Puralube Opthalmic ointment	Dechra Veterinary Product		Lubrication to prevent eye dryness during anesthesia
Tissue-Tek Prisma Plus	Sakura Finetek USA		Automated slide stainer
VISIOPHARM software	Visiopharm		Digital pathology software
	Research Diets	A06071309i	NASH inducing diet
	Purina	5053	Control animal chow
Vevo imaging station	Fujifilm VisualSonics		The Vevo imaging station is used for holding the ultrasound transducer during imaging.
Wistar Han rats	Charles River Laboratories