In situ Erforschung der murinen Megakaryopoese mittels Transmissionselektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse der Ultrastruktur der Megakaryozyten in situ mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) vor. Murine Knochenmarke werden gesammelt, fixiert, in Epoxidharz eingebettet und in ultradünnen Abschnitten geschnitten. Nach der Kontrastfärbung wird das Knochenmark unter einem TEM-Mikroskop bei 120 kV beobachtet.

Zusammenfassung

Differenzierung und Reifung von Megakaryozyten erfolgen in enger Verbindung mit den zellulären und extrazellulären Komponenten des Knochenmarks. Diese Prozesse sind durch das allmähliche Auftreten essentieller Strukturen im Megakaryozytenzytoplasma wie einem polyploiden und polylobulierten Kern, einem internen Membrannetzwerk namens Demarkationsmembransystem (DMS) und den dichten und Alpha-Granula, die in zirkulierenden Blutplättchen gefunden werden, gekennzeichnet. In diesem Artikel beschreiben wir ein standardisiertes Protokoll für die in situ ultrastrukturelle Untersuchung von murinen Megakaryozyten mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), das die Identifizierung von Schlüsselmerkmalen ermöglicht, die ihr Reifestadium und ihre Zelldichte im Knochenmark definieren. Knochenmark wird gespült, fixiert, in Ethanol dehydriert, in Kunststoffharz eingebettet und zur Erzeugung von Querschnitten montiert. Halbdünne und dünne Schnitte werden für histologische bzw. TEM-Beobachtungen hergestellt. Diese Methode kann für jede Knochenmarkzelle in jeder EM-Einrichtung verwendet werden und hat den Vorteil, dass kleine Stichprobengrößen verwendet werden, die die Kombination mehrerer Bildgebungsansätze auf derselben Maus ermöglichen.

Einleitung

Megakaryozyten sind spezialisierte große polyploide Zellen, die im Knochenmark lokalisiert sind und für die Thrombozytenproduktion verantwortlich sind¹. Sie stammen aus hämatopoetischen Stammzellen durch einen komplizierten Reifungsprozess, bei dem Megakaryozytenvorläufer zunehmend an Größe zunehmen, während sie gleichzeitig umfangreiche morphologische Veränderungen im Zytoplasma und im Zellkern erfahren². Während der Reifung entwickeln Megakaryozyten eine Reihe von unterscheidbaren Strukturelementen, darunter: ein polylobulierter Kern, Einfärbungen der Oberflächenmembran, die das Demarkationsmembransystem (DMS) bilden, ....

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den europäischen Normen 2010/63/EU und dem CREMEAS-Ausschuss für die Ethik von Tierversuchen der Universität Straßburg (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg) durchgeführt. Das Protokoll ist in Abbildung 1schematisch dargestellt.

1. Knochenmarkentnahme und -fixierung ( Abbildung 1A)

VORSICHT: Dieses Verfahren umfasst krebserzeugende, erbgutverändernde und/oder toxische Substanzen und wird unter einer chemischen Extraktionshaube durchgeführt. Tragen Sie geeignete Schutzausrü....

Ergebnisse

Histologie des Knochenmarks
Die Beobachtung der Knochenmark-Toluidin-Blau-Histologie unter einem Lichtmikroskop ist der Schlüssel zur schnellen Analyse der gesamten Gewebearchitektur in Bezug auf z.B. Gewebekompaktheit, Mikrogefäßkontinuität und die Größe und Form von Megakaryozyten (Abbildung 1D). Es wird vor ultradünnen Abschnitten durchgeführt, um die Notwendigkeit zu bestimmen, tiefer in den Knochenmarkblock zu schneiden. Aufgrund ihrer riesig.......

Diskussion

Die direkte Untersuchung von Megakaryozyten in ihrer natürlichen Umgebung ist unerlässlich, um Megakaryopoese und Thrombozytenbildung zu verstehen. In diesem Manuskript stellen wir eine Transmissionselektronenmikroskopie-Methode zur Verfügung, die Knochenmarkspülung und Fixierung durch Eintauchen kombiniert und es ermöglicht, die morphologischen Eigenschaften des gesamten Prozesses der Megakaryozytenmorphogenese im Knochenmark in situ zu sezieren.

Die Spülung des Knochenmarks is.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30)	Ladd Research Industries, USA	21310
Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar	Electron Microscopy Sciences, USA	1670-B
CaCl2 Calcium chloride hexahydrate	Merck, Germany	2083
Copper grids 200 mesh thin-bar	Oxford Instrument, Agar Scientifics, England	T200-CU
Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate	Merck, Germany	8.20670.0250
Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA)	Ladd Research Industries, USA	21340
Double Edge Stainless Razor blade	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	EM-72000
Ethanol absolut	VWR International, France	20821296
Filter paper, 90 mm diameter	Whatman, England	512-0326
Flat embedding silicone mould	Oxford Instrument, Agar Scientific, England	G3533
Glutaraldehyde 25%	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	16210
Heat plate Leica EMMP	Leica Microsystems GmbH, Austria	705402
Histo Diamond Knife 45°	Diatome, Switzerland	1044797
JEOL 2100 Plus TEM microscope	JEOL, Japan	EM-21001BU
Lead citrate - Ultrostain 2	Leica Microsystems GmbH, Austria	70 55 30 22
LX-112 resin	Ladd Research Industries, USA	21310
MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate	Sigma, France	M2393-100g
Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	15320
Nadic Methyl Anhydride (NMA)	Ladd Research Industries, USA	21350
Osmium tetroxide 2%	Merck, Germany	19172
Propylene oxide (1.2-epoxypropane)	Sigma, France	82320-250ML
Saline injectable solution 0.9% NaCl	C.D.M Lavoisier, France	MA 575 420 6
Scalpel Surgical steel blade	Swann-Morton, England	.0508
Sodium tetraborate - Borax	Sigma, France	B-9876
Sucrose	Merck, Germany	84100-1KG
Syringe filter 0.2µm	Pall Corporation, USA	514-4126
Toluidine blue	Ladd Research Industries, USA	N10-70975
Trimmer EM TRIM2	Leica Microsystems GmbH, Austria	702801
Ultramicrotome Ultracut UCT	Leica Microsystems GmbH, Austria	656201
Uranyl acetate	Ladd Research Industries, USA	23620