Implantation eines kranialen Fensters für wiederholte In-vivo-Bildgebung bei wachen Mäusen

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Implantation eines chronischen Schädelfensters für die Längsbildgebung von Gehirnzellen in wachen, kopfgefesselten Mäusen vorgestellt.

Zusammenfassung

Um die zelluläre Physiologie von Neuronen und Gliazellen bei sich benehmenden Tieren vollständig zu verstehen, ist es notwendig, ihre Morphologie zu visualisieren und ihre Aktivität in vivo bei sich verhaltenden Mäusen aufzuzeichnen. Dieses Papier beschreibt eine Methode zur Implantation eines chronischen Schädelfensters, um die Längsbildgebung von Gehirnzellen in wachen, kopfgefesselten Mäusen zu ermöglichen. In Kombination mit genetischen Strategien und viralen Injektionen ist es möglich, bestimmte Zellen und Regionen von Interesse mit strukturellen oder physiologischen Markern zu markieren. Dieses Protokoll zeigt, wie virale Injektionen kombiniert werden können, um Neuronen in der Nähe von GCaMP6-exprimierenden Astrozyten im Kortex zu markieren, um beide Zellen gleichzeitig durch ein Schädelfenster abzubilden. Multiphotonen-Bildgebung der gleichen Zellen kann für Tage, Wochen oder Monate in wachen, sich verhaltenden Tieren durchgeführt werden. Dieser Ansatz bietet Forschern eine Methode zur Betrachtung der Zelldynamik in Echtzeit und kann angewendet werden, um eine Reihe von Fragen in den Neurowissenschaften zu beantworten.

Einleitung

Die Fähigkeit, in vivo Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie im Kortex von Mäusen durchzuführen, ist von größter Bedeutung für die Untersuchung der zellulären Signalgebung und Struktur 1,2,3,4,5,6,7,8,9, der Krankheitspathologie 10,11 und der zellulären Entwicklung ^12,13

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den von der IACUC am University of Nebraska Medical Center genehmigten Richtlinien durchgeführt.

1. Vor der Operation

1. Bereiten Sie Pipetten für virale Injektionen vor. Ziehen Sie Borosilikatglaskapillaren mit einem Pipettenabzieher und fase Sie die Pipette in einem Winkel von 20°. Sterilisieren Sie die Pipetten über Nacht.
2. Bereiten Sie frische Stücke sterilen Gelschaums vor, indem Sie sie in kleine Quadrate schneiden. Tauchen Sie den Gelschaum in ein steriles Mikrofugenröhrchen, das 0,5 ml Kochsalzlösung enthält. Weichen Sie den Gelschaum vor Gebrauch mindestens 30 Minuten ....

Ergebnisse

Die Qualität des Schädelfensters kann daran gemessen werden, wie scharf die neuronalen Strukturen erscheinen. In einem guten Fenster sind dendritische Stacheln deutlich sichtbar (Abbildung 1). Mit den gespeicherten Struktur- und Positionsdaten kann dasselbe Tier wiederholt Tage, Wochen oder Monate lang abgebildet werden, um dieselben Zellen zu untersuchen (Abbildung 1). Die Bilder in Abbildung 1 wurden aus dem Vordergliedmaßenber.......

Diskussion

Hier haben wir ein Protokoll für die Implantation chronischer Schädelfenster für die In-vivo-Bildgebung von kortikalen Astrozyten und Neuronen in wachen, kopfgefesselten Mäusen auf einem luftgestützten Hauskäfig vorgestellt. Konkrete Beispiele für die kraniale Fensteranwendung zur Abbildung von Astrozyten, die GECIs und neuronale synaptische Strukturen exprimieren, wurden bereitgestellt. Mit Hilfe der Multiphotonenmikroskopie können astrozytäre Calciumsignaldynamiken und strukturelle synaptische Dynamik.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
15o Pointed Blade	Surgistar	6500	Surgery Tools
19 G Needles	BD	305186	Surgery Supply
AAV1-CAG-FLEX-tdTomato	Addgene	28306-AAV1	Viral Vector
AAV1-CaMKII-0-4-Cre	Addgene	105558-AAV1	Viral Vector
Acteone	Fisher Scientific	A16P4	Reagent
Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	Covidien 5750	Surgery Supply
Beveler	Narishige		Equipment
Borosilicate Glass	World Precision Instruments	TW100F-4	Surgery Supply
Carbide Burs	SS White Dental	14717	Surgery Tools
Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL	Zoetis Mylan Institutional, LLC.		Drug
Compressed Air	Fisher Scientific	23-022-523	Surgery Supply
Cotton Tip Applicators	Puritan	836-WC NO BINDER	Surgery Supply
Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm	Warner Instruments	64-0720, 64-0700	Surgery Supply
Dental Drill	Aseptico		Equipment
Dexamethasone, 4 mg/mL	Mylan Institutional, LLC.		Drug
Dissecting Microscope	Nikon		Equipment
Duralay Liquid  (dental cement liquid)	Patterson Dental	602-8518	Reagent
Duralay Powder  (dental cement powder)	Patterson Dental	602-7932	Reagent
Enrofloxacin, 2.27%	Bayer		Drug
Eye Ointment	Dechra	17033-211-38	Surgery Supply
Fiber Lite High Intensity Illuminator	Dolan-Jenner Industries		Equipment
Forceps (Large)	World Precision Instruments	14099	Surgery Tools
Forceps (Small)	World Precision Instruments	501764	Surgery Tools
GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J	The Jackson Laboratory	Stock No: 024105	Mouse line
Germinator	Fisher Scientific		Equipment
GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J	The Jackson Laboratory	Stock No: 012586	Mouse Line
Headplate	Neurotar	Model 1, Model 3	Surgery Supply
Hemostatic forceps	World Precision Instruments	501705	Surgery Tools
Holder for 15o Pointed Blade	World Precision Instruments	501247	Surgery Tools
Holder for Scalpel Blades	World Precision Instruments	500236	Surgery Tools
Iodine Prep Pads	Avantor	15648-926	Surgery Supply
Isoflurane	Piramal		Surgery Supply
Isoflurane table top system with Induction Box	Harvard Apparatus		Equipment
Isoflurane Vaporizer	SurgiVet		Equipment
Krazy Glue	Office Depot	KG517	Reagent
Loctite 401	Henkel	40140	fast-curing instant adhesive
Loctite 454	Fisher Scientific	NC9194415	cyanoacrylate adhesive gel
Micropipette Puller	Sutter Instruments		Equipment
Multiphoton Microscope			Equipment
Nitrogen	Matheson	NI M200	Gas
Oxygen	Matheson	OX M250	Gas
Picospritzer	Parker		intracellular microinjection dispense system
Pipette Tips	Rainin	17014340	Surgery Supply
Rodent Hair Trimmer	Wahl		Equipment
Saline (0.9% Sodium Chloride)	Med Vet International	RX0.9NACL-30BAC	Surgery Supply
Scalpel Blades, Size 11	Integra	4-111	Surgery Tools
Scissors	World Precision Instruments	503667	Surgery Tools
Stereotaxic Instrument	Stoelting		Equipment
Sugi Sponge Strips (sponge strips)	Kettenbach Dental	31002	Surgery Supply
SURGIFOAM (gel foam)	Ethicon	1972	Surgery Supply
Syringe with 26 G Needle	BD	309625	Surgery Supply
Tamoxifen	Sigma Aldrich	T5648-1G	Reagent
Ti:Sapphire Laser	Coherent		Equipment
Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM	Surgery Supply
Water Blanket	Fisher Scientific		Equipment
Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL	Fresenius Kabi USA		Drug