Nachweis der G-Protein-gekoppelten Rezeptorexpression in vagalen afferenten Neuronen der Maus mittels Multiplex-In-situ-Hybridisierung

Zusammenfassung

Multiplex in situ Hybridisierung (ISH) wurde verwendet, um gleichzeitig die Transkripte für zwei G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und einen Transkriptionsfaktor im gesamten vagalen ganglionären Komplex der erwachsenen Maus zu visualisieren. Dieses Protokoll könnte verwendet werden, um genaue Karten der Transkriptionsprofile von vagalen afferenten Neuronen zu erstellen.

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt ein Protokoll für die Multiplex-in-situ-Hybridisierung (ISH) der Maus-Jugular-Nodose-Ganglien, mit besonderem Schwerpunkt auf dem Nachweis der Expression von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Formalin-fixierte Jugular-Nodose-Ganglien wurden mit der RNAscope-Technologie verarbeitet, um gleichzeitig die Expression von zwei repräsentativen GPCRs (Cholecystokinin- und Ghrelin-Rezeptoren) in Kombination mit einem Markergen entweder der Nodose (paarartige Homöobox 2b, Phox2b) oder jugularen afferenten Neuronen (PR-Domäne Zinkfingerprotein 12, Prdm12) nachzuweisen. Markierte Ganglien wurden mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet, um die Verteilungs- und Expressionsmuster der oben genannten Transkripte zu bestimmen. Kurz gesagt, phox2b afferente Neuronen wurden gefunden, um reichlich den Cholecystokinin-Rezeptor (Cck1r) zu exprimieren, aber nicht den Ghrelin-Rezeptor (Ghsr). Es wurde auch festgestellt, dass eine kleine Untergruppe von Prdm12-afferenten Neuronen Ghsr und / oder Cck1r exprimiert. Der in diesem Artikel beschriebene Ansatz kann Wissenschaftlern helfen, genaue Karten der Transkriptionsprofile vagaler afferenter Neuronen zu erstellen.

Einleitung

Die Zellkörper der vagalen Afferenzen sind in den Jugular-, Petrosal- und Nodose-Ganglien^1,2,3enthalten. Ihre Axone wandern zusammen über mehrere Äste des Vagusnervs zu den kraniozervikalen, thorakalen und abdominalen Territorien^4,5,6,7. Von ihren viszeralen Enden aus können vagale Afferenzen auf eine Breite von physiologischen und schädlichen Reizen reagieren^8,9,

Protokoll

HINWEIS: Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden, waren Wildtyp-Männchen auf einem reinen C57BL / 6J-Hintergrund. Insgesamt wurden 4 Mäuse für Multiplex-ISH verwendet. Alle Mäuse waren zum Zeitpunkt des Opfers etwa 8 Wochen alt. Eine männliche Maus (etwa ein Jahr alt) wurde auch verwendet, um endogene Fluoreszenz im Zusammenhang mit dem Altern nachzuweisen. Die Tiere wurden in belüfteten Käfigen in einer Barriereeinrichtung mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht. Das UT Southwestern Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee überprüfte und genehmigte die unten beschriebenen Verfahren. Details zu Reagenzien und Werkzeuge....

Ergebnisse

Während RNAScope bei Tieren jeden Alters, Geschlechts oder genetischen Hintergrunds angewendet werden kann, ist es ratsam, mit jungen Erwachsenen (<3 Monate alt) zu arbeiten. Dies liegt daran, dass fluoreszierende Artefakte (z. B. Lipofuscin) häufige Befunde in Neuronen älterer Tiere sind⁴¹. Die formalinfixierten Ganglien älterer Mäuse enthalten oft eine überraschend intensive endogene Fluoreszenz, die leicht mit einer echten Färbung verwechselt werden kann (Abbildung 1.......

Diskussion

Die Technik der ISH wurde in den späten 1960er Jahren erfunden⁴². Erst Mitte der 1980er Jahre wurde es jedoch zum Nachweis von mRNAs im zentralen und peripheren Nervensystem eingesetzt^43,44. In Anbetracht der Heterogenität des Nervensystems und wiederkehrender Probleme mit Antikörpern bleibt die Lokalisierung eines bestimmten Transkripts auf zellulärer Ebene ein unschätzbares Werkzeug. Dennoch sind die traditionellen ISH-Methoden müh.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	Fisher Scientific	BP399-4
20x SSC	Invitrogen	AM9763
-80°C freezer	PHCBI	MDF-DU901VHA-PA
Adobe Photoshop 2021	Adobe		photo and design software
Baking oven	Thermo Scientific	Model:658
Confocal microscope	Zeiss	LSM880 Airyscan
Cover glass	Brain Research Laboratories	2460-1.5D
Cryostat	Leica	CM 3050 S
Dumont #5 Forceps	F.S.T.	11252-20
Ecomount	Biocare Medical	EM 897L	mounting medium
HybEZ oven			hybridization oven
Hydrophobic pen	Vector Laboratories	H-4000
ImageJ-Fiji	NIH
Large scissors	Henry Schein	100-7561
Micro centrifuge tubes	VWR	20170-333
Minipump variable flow	Fisher Scientific	13-876-1
Opal 520	Akoya biosciences	FP1 1487001KT	Fluorescent biomarker
Opal 570	Akoya biosciences	FP1 1488001KT	Fluorescent biomarker
Opal 690	Akoya biosciences	FP1 1497001KT	Fluorescent biomarker
ProLong Gold Antifade Mountant			mounting medium for fluorescently labeled cells
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2	ACD /Bio-Techne	323100	multiplex kit
RNAscope probe Mouse Cck1r-C3	ACD /Bio-Techne	313751-C3
RNAscope probe Mouse DapB	ACD /Bio-Techne	310043
RNAscope probe Mouse Ghsr	ACD /Bio-Techne	426141
RNAscope probe Mouse Phox2b-C2	ACD /Bio-Techne	407861-C2
RNAscope probe Mouse Prdm12-C2	ACD /Bio-Techne	524371-C2
RnaseZap	Sigma	R2020	Rnase decontaminating solution
Small dissecting scissors	Millipore Sigma	Z265977
Superfrost Plus slides	Fisherbrand	1255015
Tissue Tek OCT medium	Sakura	4583
User manual	ACD	323100 USM
Vannas Spring Scissors	Roboz	RS 5620
ZEN Imaging Software	Zeiss