Effektive orale RNA-Interferenz (RNAi) Verabreichung an erwachsene Anopheles gambiae-Mücken

Zusammenfassung

Die orale Verabreichung von dsRNA, die von Bakterien produziert wird, eine Verabreichungsmethode für RNA-Interferenz (RNAi), die routinemäßig bei Caenorhabditis elegans angewendet wird, wurde hier erfolgreich auf erwachsene Moskitos angewendet. Unsere Methode ermöglicht robuste Studien zur Umkehrgenetik und übertragungsblockierende Vektorstudien ohne den Einsatz von Injektionen.

Zusammenfassung

RNA-Interferenz ist seit zwei Jahrzehnten ein stark genutztes Werkzeug für die umgekehrte genetische Analyse. Bei erwachsenen Mücken wurde die Verabreichung von doppelsträngiger RNA (dsRNA) hauptsächlich durch Injektion durchgeführt, was viel Zeit in Anspruch nimmt und für Feldanwendungen nicht geeignet ist. Um diese Einschränkungen zu überwinden, stellen wir hier eine effizientere Methode zur robusten Aktivierung von RNAi durch orale Abgabe von dsRNA an erwachsene Anopheles gambiae vor. Lange dsRNAs wurden im Escherichia coli-Stamm HT115 (DE3) hergestellt, und eine konzentrierte Suspension von hitzeabgetöteten dsRNA-haltigen Bakterien in 10% Saccharose wurde erwachsenen Moskitos auf Wattebällchen ad libitum angeboten. Wattebällchen wurden alle 2 Tage für die Dauer der Behandlung ausgetauscht. Die Verwendung dieser Methode zur Zielung von Doppelgeschlecht (ein Gen, das an der Geschlechtsdifferenzierung beteiligt ist) oder Gabelkopf (der für einen Speicheldrüsentranskriptionsfaktor kodiert) führte zu einer reduzierten Zielgenexpression und / oder einem Proteinimmunfluoreszenzsignal, gemessen durch quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) bzw. Fluoreszenzkonfokalmikroskopie. Defekte in der Speicheldrüsenmorphologie wurden ebenfalls beobachtet. Diese hochflexible, benutzerfreundliche, kostengünstige und zeiteffiziente Methode der dsRNA-Abgabe könnte breit auf Zielgene anwendbar sein, die für die Insektenvektorphysiologie und darüber hinaus wichtig sind.

Einleitung

Viele Krankheiten werden durch Moskitos übertragen, was das Studium der Physiologie und Genetik von Mücken zu einem wichtigen Unterfangen macht. Die Verwendung von RNAi in diesen Organismen war in den letzten 20 Jahren prominent und ermöglichte die funktionelle Charakterisierung vieler Mückengene 1,2,3,4,5. Die am häufigsten verwendete Technik für die dsRNA-Abgabe war die Mikroinjektion, die den Nachteil hat, dass sie die Moskitos verletzen kann und viel Zeit und Mühe erfordert. Orale Verabreichungsmethoden für RNAi wurden getestet, aber hauptsächlich im Larvenstadium der Moskitos 6,7,8,9. Die orale Verabreichung von dsRNA in erwachsenen Moskitos wurde nicht vollständig erforscht und könnte ein nützliches Werkzeug für das Studium der Vektorbiologie und Vektorkontrolle sein.

Malaria wird von Anopheles-Mücken übertragen, wenn eine infizierte weibliche Mücke eine Blutmahlzeit von einem nicht infizierten Wirt nimmt und Speichel injiziert, der Malariaparasiten^{enthält 10}. Um letztendlich im Speichel einer Mücke übertragen zu werden, muss der Parasit viele Hürden überwinden, einschließlich der Umgehung des Moskito-Immunsystems, der Durchquerung der Mitteldarmbarriere und der Invasion der Speicheldrüsen¹¹. Die Architektur der Mückenspeicheldrüse (SG) ist der Schlüssel zur Parasiteninvasion und diese Architektur wird sowohl von wichtigen Speicheldrüsen-exprimierten Transkriptionsfaktoren als auch von Determinanten des Sexualdimorphismus gesteuert. Mehrere hochkonservierte Transkriptionsfaktoren sind für die zelluläre Spezifikation und homöostatische Aufrechterhaltung der Speicheldrüsen sowie für die Produktion und Sekretion von Speichelproteinen erforderlich, die bei der Bluternährung funktionieren^12,13,14. Der Gabelkopf (Fkh) ist ein geflügelter Helix-Transkriptionsfaktor, der als Hauptregulator der Struktur und Funktion des Insekten-SG fungiert (basierend auf Studien an Fruchtfliegen und der Seidenraupenmotte) ^{15,16,17,18,19,20}. In den Drosophila SGs funktioniert Fkh mit Salbei, einem SG-spezifischen grundlegenden Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktor (bHLH), um das Überleben von SG und die Speichelproduktion^{zu fördern 19}. Ein wichtiger, positiver Co-Regulator der Speichelproduktion bei Drosophila ist CrebA, ein gut untersuchter Leucin-Reißverschluss-Transkriptionsfaktor, der die Expression der sekretorischen Signalweggene^21,22,23 hochreguliert. Es gibt auch ein hohes Maß an morphologischer Differenzierung in weiblichen Speicheldrüsen, die wahrscheinlich eine Schlüsselrolle spielen, nicht nur bei der Bluternährung, sondern auch bei der Fähigkeit von Parasiten, in dieses Gewebe einzudringen²⁴.

Viele der Gene, die an der Bestimmung des Überlebens, der Struktur, der Physiologie und des Sexualdimorphismus der Speicheldrüse beteiligt sind, haben komplexe raumzeitliche Expressionsprofile^25,26,27, und die traditionellen Verabreichungsmethoden von dsRNA zur Induktion von RNAi sind nicht immer effizient^, um diese Art von Genen in diesem oder anderen Geweben anzugreifen. Die orale Abgabe von dsRNA im Larvenstadium Aedes aegypti und An. gambiae mosquitoes wurde jedoch erfolgreich eingesetzt, um die frauenspezifische Form des dsx-Gens ^9,28 zum Schweigen zu bringen. Frühere Studien mit dsRNA in Mückenspeicheldrüsen ergaben, dass, obwohl große Mengen an dsRNA erforderlich waren, der Silencing-Effekt relativ lang anhaltend war (mindestens 13 Tage)²⁹. Hier wurde die Fähigkeit des hitzetoten E. coli-Stammes HT115 (DE3), der sequenzspezifische dsRNA für dsx, fkh oder CrebA exprimiert, getestet, um RNAi-Silencing dieser Gene in erwachsenen weiblichen Moskitos zu induzieren. Orale Verabreichung von dsRNA-induziertem Gen-Knockdown in An. gambiae, mit deutlichen Reduktionen der mRNA-Spiegel und mit Phänotypen, die mit dem Funktionsverlust dieser Gene übereinstimmen. Daher wird dieser Ansatz wahrscheinlich dazu beitragen, die Funktion einer Vielzahl von Speicheldrüsengenen zu unterdrücken.

Protokoll

1. Klonierung von dsRNA in E. coli-Expressionsvektor

1. Wählen Sie die Zielgensequenz aus, die in einen geeigneten Vektor für die Expression von dsRNA eingefügt werden soll. Rufen Sie die Ausdruckswerte mithilfe der folgenden Methode aus Vectorbase.org ab.
   1. Suchen Sie im Suchfeld der Homepage nach einem Gen von Interesse (z. B. Tabelle 1).
   2. Navigieren Sie auf der resultierenden Genseite zur 8. Abschnitt Transkriptomik .
   3. Suchen Sie nach den aufgelisteten relevanten RNA-Seq- und Microarray-Genexpressionsexperimenten.
   4. Transkribieren Sie interessante Werte in die Tabellenkalkulationssoftware und erstellen Sie eine Datentabelle.
2. Wählen Sie ein handelsübliches Plasmid mit mindestens einem T7-Promotor für die Verwendung aus. Wenn das ausgewählte Plasmid nur einen T7-Promotor hat (wie es die meisten kommerziellen Plasmide tun), fügen Sie einen zweiten T7-Promotor in den umgekehrten Primer ein, der für die Amplifikation der dsDNA für das Gen von Interesse verwendet wird.
   HINWEIS: Die dsRNA-Sequenz für die Zielgene kann mit der Webapplikation E-RNAi für das Design von RNAi-Reagenzien³⁰ ausgewählt werden. Entweder lange dsRNA (ca. 400 bp) oder kurzhaarige dsRNA (shRNA) können basierend auf spezifischen Gensequenzen entworfen werden. Diese Sequenzen sollten vor dem Klonen zur Identitätsbestätigung verstärkt und sequenziert werden. Die ausgewählten Genregionen, Plasmide und Promotoren, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Ergänzungsdatei 1 aufgeführt.
3. Führen Sie das Klonen nach einem einfachen einstufigen Verfahren durch, das zuvor beschrieben^{wurde 9,31}. Zu diesem Zweck reinigen Sie das PCR-Produkt und ligrieren Sie zu der linearisierten Plasmid-DNA. Verwenden Sie das Produkt der Ligatur für die Hitzeschock-Umwandlung von kompetenten E. coli-Zellen ³². Markieren Sie die transformierten Zellen durch Blau/Weiß-Abblendung. Bestätigen Sie die Ausrichtung des Einsatzes mit einer T7-Primer PCR und bestätigen Sie die Sequenz mit M13-Primern.
   HINWEIS: Weiß/Blau-Screenings können verwendet werden, wenn das für die Transformation ausgewählte Plasmid das lacZ-Gen trägt, das für β-Galactosidase kodiert. Weiße Kolonien sollten den gewünschten Einsatz innerhalb des lacZ enthalten und können ausgewählt werden, um das Vorhandensein und die Ausrichtung der Zielsequenz³³ weiter zu bestätigen.
4. Reinigen Sie das Plasmid aus der ersten Umwandlung und verwenden Sie es, um kompetentes E. coli HT115 (DE3) wie zuvor beschrieben³⁴ umzuwandeln. Nach der Bestätigung, dass das Plasmid mit dem Einsatz im kompetenten E. coli HT115 (DE3) vorhanden ist, machen Sie Glycerinvorräte von Bakterien für den einmaligen Gebrauch.
   HINWEIS: Eine geeignete, nicht verwandte Kontroll-dsRNA sollte in jedem Experiment erworben oder für die Verwendung vorbereitet werden. In diesem Fall wird die Sequenz für das nicht verwandte Gen Aintegumenta (Ameise) von Arabidopsis thaliana verwendet.

2. Herstellung von hitzeabgetöteten Bakterien, die dsRNA exprimieren

1. Züchten Sie eine Kultur aus einer einzigen Bakterienkolonie des E. coli-Stammes HT115 (DE3), die das dsRNA-exprimierende Plasmid in 50 ml Luria-Brühe (LB) mit 100 μg/ml Ampicillin und 12,5 μg/ml Tetracyclin enthält, auf einem Plattform-Shaker (180 U/min) bei 37 °C für 12 h.
2. Verdünnen Sie die Bakterienkultur (1:1000) in 2x Hefevertrypton (2x YT) Medien mit 100 μg/ml Ampicillin und 12,5 μg/ml Tetracyclin.
3. Induzieren Sie die dsRNA-Produktion durch Zugabe von 40 μM (Endkonzentration) Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG).
4. Wenn die Zellen einen O.D.600 = 0,4 erreichen, etwa nach 2 h Induktion bei 37 °C mit Bewegung bei ₁₈₀ U/min, bereiten Sie eine konzentrierte Suspension von hitzeabgetöteten Bakterien vor, wie in Taracena et al ⁹ beschrieben. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation (4000 x g, 4 °C , 10 min) und waschen Sie die Zellen in einem Volumen Natriumphosphatpuffer (PBS).
5. Drehen Sie erneut unter den gleichen Bedingungen, suspendieren Sie in PBS auf 1/100 des ursprünglichen Volumens und legen Sie es für 1 h bei 70 ° C.
6. Machen Sie 400 μL Aliquots der wärmeabgetöteten Bakterien und lagern Sie diese Aliquots bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung (nicht länger als eine Woche lagern). Diese Suspension von hitzeabgetöteten Bakterien enthält die spezifische dsRNA für die RNAi-Experimente. Führen Sie dieses Verfahren sowohl für das Zielgen dsRNA-Bakterien als auch für die un-verwandte dsRNA-Kontrolle durch, die in jedem Experiment verwendet werden soll.

3. Fütterung von Moskitos mit wärmeabgetöteten Bakterien, die dsRNA exprimieren

1. Tauen Sie ein Aliquot dsRNA (HT115 (DE3) Bakteriensuspension) auf und mischen Sie mit 1,6 ml 12% Zuckerlösung, die 0,2% Methylparaben enthält.
2. Weichen Sie einen kleinen Wattebausch in diese Lösung ein und legen Sie den eingeweichten Wattebausch in einen Käfig mit 5 Tage alten Moskitos. Stellen Sie sicher, dass sich die Moskitos von dieser Lösung ernähren und gleichzeitig sowohl den Zucker als auch die dsRNA-haltigen Bakterien aufnehmen.
3. Wechseln Sie den in dsRNA-Zuckerlösung getränkten Wattebausch jeden zweiten Tag an 8 aufeinanderfolgenden Tagen.
4. Halten Sie Mückenkäfige unter konstanten Bedingungen, d.h. 27 ° C und 80% relative Luftfeuchtigkeit mit einer Photoperiode von 12 h: 12 h Licht: dunkler Fotozyklus, getrennt durch eine 30-minütige Dämmerungs- und 30-minütige Dämmerungsperiode.

4. Untersuchen Sie die Zielgenexpressionsniveaus

1. Betäuben Sie die Moskitos kalt, indem Sie den Behälter für eine Minute auf Eis legen oder bis sich die Moskitos nicht mehr bewegen. Sobald die Moskitos betäubt sind, legen Sie sie auf eine kalte Oberfläche, um Weibchen für die Dissektion zu isolieren.
2. Sprühen Sie 70% Ethanol auf die Moskitos und legen Sie sie mit PBS auf eine Glasoberfläche. Sichern Sie mit einer Pinzette den Mückenkopf stabil und ziehen Sie den Thorax sehr langsam, so dass die Speicheldrüsen in das PBS freigesetzt werden können.
3. Halten Sie die Speicheldrüsen in eiskaltem PBS, bis 10 Individuen seziert wurden. Pool Ten SGs für die RNA-Extraktion mit der Guanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform-Methode. Suspendieren Sie das RNA-Pellet in 30 μL RNase-freiem Wasser.
4. Verwenden Sie 1 μL Aliquot der RNA, die im vorherigen Schritt aus dem SG extrahiert wurde, um die Absorption bei 260 und 280 nm abzulesen und die RNA-Konzentration jeder Probe durch Multiplikation mit dem Verdünnungsfaktor zu berechnen. Ein Verhältnis von 260/280 von ~2,0 weist auf eine gute Qualität der RNA hin.
5. Verwenden Sie 1 μg der gereinigten RNA, um komplementäre DNA (cDNA) mit einem kommerziellen Reverse-Transkriptionskit zu synthetisieren.
6. Nehmen Sie eine 1:10-Verdünnung der cDNA vor, um eine RT-PCR-Reaktion gemäß den Empfehlungen des Herstellers vorzubereiten. Bereiten Sie für jede Probe eine Reaktion für das Zielgen vor und richten Sie parallel eine Reaktion mit dem Housekeeping-Gen (HK) ein. Setzen Sie jede Genreaktion in eine technische Verdreifachung, um die Auswirkungen der zufälligen Variation aus der Methode zu eliminieren.
   HINWEIS: Hier wurden das ribosomale S7-Gen An. gambiae (GeneBank: L20837.1) und Actin (VectorBase: AGAP000651) als HK-Gene verwendet.
7. Verwenden Sie alle Primer in einer Endkonzentration von 300 nM gemäß den Anweisungen des SYBR-green-Herstellers. Amplifizieren mit Standard-PCR-Bedingungen: 95 °C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen von 15 s bei 95 °C und 60 s bei 60 °C.
   HINWEIS: Zur Quantifizierung der Genexpression wird die Delta-Delta-Ct-Methode (ΔΔCt) verwendet. Delta Ct (ΔCt) ist der Unterschied zwischen dem Ct des Zielgens und dem Ct des Housekeeping-Gens. ΔΔCt ist die Differenz zwischen dem ΔCt der Versuchsgruppe und dem ΔCt der Kontrollgruppe³⁵.

5. Phänotypische Bewertung: erfolgreiche Blutfütterung

1. Um die Fähigkeit zur Bluternährung zu bewerten, legen Sie Gruppen von 15 weiblichen Moskitos, die mit Ziel- und Kontroll-dsRNA behandelt werden, auf kleine Käfige (12 cm Durchmesser) und verhungern Sie sie für 4 h.
2. Mit einem zirkulierenden Wasserbad, das auf 37 ° C eingestellt ist, bieten Glasmückenfresser (24 mm Durchmesser) und Parafilmmembran den Moskitos defibriniertes Schafblut.
   HINWEIS: Blut kann von einem kommerziellen Verkäufer bezogen werden, der es aseptisch von gesunden Spendertieren US-amerikanischer Herkunft entnimmt und manuell ohne Antikoagulanzien oder Zusatzstoffe defibriniert.
3. Zählen und zeichnen Sie durch direkte Beobachtung die Anzahl der Sondierungsversuche auf, um erfolgreich eine Blutmahlzeit von den ersten fünf Weibchen zu erhalten, um in jeder Gruppe vollständig verstopft zu werden.
   HINWEIS: Um signifikante metabolische Veränderungen bei den Moskitos zu vermeiden, die die Energieressourcen beeinträchtigen könnten, die das blutsuchende Verhalten beeinflussen, wurde der Hunger auf ein Minimum reduziert (4 h). Infolgedessen würde nicht jede Mücke eifrig nach der Blutmahlzeit suchen, und wir haben die Anzahl der verstopften Weibchen auf fünf (ein Drittel der Gesamtmenge jeder Gruppe) begrenzt, um die Auswirkungen von Zeitvariablen wie Exposition gegenüber menschlichem Geruch, Temperaturänderung zwischen den Kammern und den Futterflächen usw. zu reduzieren.

6. Phänotypische Bewertung: Speicheldrüsenmorphologie und Herunterregulierung relevanter Proteine

1. Isolieren Sie frisches Gewebe in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), wie in Schritt 4.2 beschrieben, und fixieren Sie es in eiskaltem Aceton für 90 s. Nach dem Entfernen des Acetons mehrmals in 1x PBS abspülen. Inkubieren mit primären Antikörpern über Nacht bei 4 °C mit Antiserum (siehe Materialtabelle), verdünnt in 1x PBS.
   HINWEIS: Siehe Materialtabelle zur Identifizierung der primären Antikörper, die für Speichelproteine verwendet werden (Anopheles Anti-Thrombozyten-Protein, AAPP; Mucin 2, MUC2), SG-Transkriptionsfaktoren (Fork Head, fkh; Salbei, Salbei; Cyclic-AMP-Antwortelement-bindendes Protein A, CrebA) und ein Marker für sekretorische Vesikel (Rab11). Diese Antikörper werden als Auslesungen für SG-Form und -Funktion verwendet. Jeder Antikörper, der für die Immunfluoreszenz geeignet ist, sollte jedoch für dieses Protokoll geeignet sein.
2. 1x PBS mehrmals waschen. Sekundäre Antikörper (fluoreszierend), verdünnt in 1x PBS, hinzufügen und im Dunkeln bei Raumtemperatur für 2 h inkubieren. Fügen Sie einen beliebigen Gegenfleck hinzu [z. B. 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI; DNA), Weizenkeimagglutinin (WGA; für Chitin), Phalloidin (für F-Aktin) und/oder Nilrot (für Lipide)] 30 min vor Ende der 2-stündigen Inkubation.
3. Dreimal waschen in 1x PBS. Montieren Sie dann das Gewebe in 100% Glycerin auf einem Standard-Objektträger mit einem 1 mm dicken Deckglas und lagern Sie es bei -20 ° C, bis Sie es mit einem Fluoreszenz-Konfokalmikroskop abbilden.
   HINWEIS: Um quantitative Daten zu erhalten, müssen die Bildgebungseinstellungen konstant gehalten werden. Hier wurden nur Projektionsbilder mit maximaler Intensität über das gesamte 3D-Volumen des Gewebes aufgenommen, und die gesamte Bildquantifizierung wurde zwischen den Behandlungen (innerhalb eines Experiments) auf der Grundlage des DAPI-Signals in Nicht-SG-Geweberesten (Fettkörper, Kutikula oder Kopf), die ebenfalls auf dem Objektträger vorhanden sind, normalisiert.

Ergebnisse

Zu Beginn wurden Microarray-Expressionsdaten von VectorBase verwendet, um potenzielle Ziele in den Entwicklungsstadien^36,37 zu scannen^, um den Expressionsstatus aller für die aktuelle Studie relevanten Gene zu bestimmen (Tabelle 1). Wie erwartet, zeigten alle von uns ausgewählten Zielgene eine Expression bei erwachsenen SGs. Die Gehalte an Aapp und Salbei waren besonders hoch (Tabelle 1). Bemerkenswert waren auch die hohen Expressionsniveaus von f-Agdsx bei erwachsenen weiblichen SGs⁹.

Spezifische Segmente aus jedem Gen wurden für die Verwendung als dsRNA mit der Webanwendung E-RNAi für das Design von RNAi-Reagenzien³⁰ evaluiert. Die ~ 400 bp-Regionen, die Sequenzen enthalten, die für jedes Zielgen einzigartig sind, wurden dann kloniert (Abbildung 1A), in die entsprechenden Bakterienstämme umgewandelt und zur Herstellung von Suspensionen hitzeabgetöteter Bakterien verwendet, die zur Produktion von dsRNA induziert wurden. Erwachsene Moskitos wurden 8 Tage lang mit den mit Saccharose getränkten Wattebällchen gefüttert, die die bakteriellen Suspensionen von dsRNA für f-Agdsx, fkh oder Ameise (die nicht verwandte Negativkontrolle) enthielten.

Für die Analyse der RNAi-Fütterung weiblicher Mücken wurde zunächst festgestellt, ob f-Agdsx oder fkh dsRNA-Fütterungen Gen-Silencing induzieren. Eine 98,8%ige Reduktion (±2,1) der fkh-Transkriptspiegel wurde in der Gruppe beobachtet, die mit fkh-dsRNA gefüttert wurde (Abbildung 1B), was darauf hindeutet, dass die dsRNA die Häufigkeit von fkh-Transkripten in SGs sehr effektiv reduzierte. Überraschenderweise wurden die fkh-mRNA-Spiegel bei den mit dsRNA für f-Agdsx behandelten Moskitos um 82,0% (±18,9) reduziert, die eine f-Agdsx-Reduktion von 89,86% (±4,48) aufwiesen. deutet darauf hin, dass fkh ein Ziel von F-Dsx in der Speicheldrüse sein könnte. Parallel zu der signifikanten Verringerung der fkh-Expressionsniveaus zeigten die fkh-Knockdown-Moskitos einen signifikanten Anstieg der Anzahl der Sondierungsversuche, die zur Bluternährung erforderlich waren. Diese Moskitos zeigten im Durchschnitt fünfmal mehr Fütterungsversuche als die Kontrollgruppe oder f-Agdsx dsRNA-gefütterte Moskitos, die vollständig mit Blut überschwemmt waren (Abbildung 1C). Dies führte zu der Frage, ob die fkh-Knockdown-RNAi-Behandlungen Veränderungen in der Lokalisation und/oder Verteilung wichtiger transkriptioneller Regulatoren (SG TFs Sage und CrebA) (Abbildung 2), sezernierter Proteine (AAPP und Mucin) (Abbildung 3) und sekretorischer Maschinerie [Nilrot (Lipide) und Rab11 (sekretorische Vesikel)] (Abbildung 4) verursachten. Wichtig ist, dass erhebliche Unterschiede in der Färbeintensität zwischen verschiedenen Lappenregionen, Lappen und einzelnen SGs beobachtet wurden.

Wie vorhergesagt, waren die Salbei- und CrebA-Färbungen in allen SG-Lappen nach fkh-RNAi (Abbildung 2B) im Vergleich zu Ameisenkontroll-RNAi (Abbildung 2A) deutlich reduziert (Abbildung 2A). Reduktionen sowohl der höchsten Maximalintensitätswerte (rote gestrichelte Linien und numerische Beschriftungen) als auch der niedrigsten Maximalintensitätswerte (blaue gestrichelte Linien und numerische Beschriftungen) in Zeilenscanprofilen deuteten auf Reduzierungen in Bereichen mit hohem und niedrigem Signal innerhalb des Gewebes hin (Abbildungen 2A, B). Diese Daten deuten darauf hin, dass An. gambiae fkh RNAi wirksam ist und dass fkh die Produktion und/oder Stabilität der SG TFs Sage und CrebA in An. gambiae reguliert, analog zu ihrer genetischen Verwandtschaft in Drosophila SGs^19,38,39.

Unter Berücksichtigung von hochreichlich vorhandenen Speichelkomponentenproteinen waren die Spiegel des Anopheles-Anti-Thrombozyten-Proteins (AAPP)^40,41 in allen drei SG-Lappen nach fkh-RNAi im Vergleich zur Kontroll-RNAi-Behandlung reduziert (Abbildung 3A,B; grün). Auf der anderen Seite wurden keine Veränderungen der Mucin-Spiegel beobachtet (Abbildung 3A,B; lila). Diese Daten deuten darauf hin, dass Fkh unterschiedlich zur Expression verschiedener Speichelproteingene beiträgt.

Schließlich wurden zwei Sekretionsmarker beobachtet (Abbildungen 4A,B): Rab11 (Vesikel assoziiert mit apikalen Recycling-Endosomen⁾⁴² und Nilrot (Lipide). Eine reduzierte Rab11-Fluoreszenz wurde in distalen lateralen (DL) Lappen nach fkh-RNAi-Behandlung beobachtet (Abbildung 4A v vs. 4B v; grün). Es trat jedoch auch ein erhöhtes Rab11-Signal in den medialen (M) und proximalen lateralen (PL) Lappen auf (Abbildung 4A vii, ix vs. 4B vii, ix; grün). Im Nilrotsignal (Abbildungen 4A,B; lila) wurde nach fkh RNAi kein Unterschied im Vergleich zur Kontroll-RNAi-Behandlung beobachtet. Diese Daten deuten darauf hin, dass die fkh-Reduktion eine sekretorische Maschinenaktion auf komplexe Weise verändern kann, die sich zwischen den SG-Lappen unterscheidet.

		Dataset:	Goltsev	Neira Oviedo	Neira Oviedo	Bäcker	Bäcker	Bäcker	Bäcker
Gensymbol	Funktion	AGAP ID	Embryo (25 Std.)	L3-Larven	L3 SG	erwachsenes Weibchen Körper (3 Tage)	erwachsener Rüde Körper (3 Tage)	erwachsenes Weibchen SG (3 Tage)	erwachsener Rüde SG (3 Tage)
AAPP	Speichelprotein	AGAP009974	3.92	4.38	4.33	3.81	2.46	11.92	2.69
CrebA	TxN-Faktor	AGAP001464	6.28	5.22	5.92	2.99	2.96	3.27	3.13
"	TxN-Faktor	AGAP011038	4.50	4.46	5.23	2.96	2.86	3.05	2.88
Dsx	TxN-Faktor	AGAP004050	4.91	5.39	5.55	3.72	4.00	4.57	4.01
FKH	TxN-Faktor	AGAP001671	5.18	4.67	5.25	2.99	3.09	3.21	3.05
MUC2	Speichelprotein	AGAP012020	4.59	5.53	5.63	2.96	3.07	3.08	3.26
Rab11	vesikulärer Handel	AGAP004559	10.21	7.47	8.60	4.90	3.79	3.38	2.96
Salbei	TxN-Faktor	AGAP013335	5.32	5.96	8.89	3.40	3.33	7.37	7.23

Tabelle 1: Mittlere log2-Microarray-Ausdrucksprofile für An. Gambiae Gene von Interesse. Gezeigt werden Gennamen, Funktionskategorien, Vectorbase (AGAP)-Identifikatoren und mittlere Log2-Microarray-Expressionsdaten, die von Vectorbase gesammelt wurden. Diese Daten deuten darauf hin, dass unsere Gene von Interesse (beteiligt an der Zellbiologie und Sekretion der Speicheldrüse (SG)) im Larvenstadium 3 (L3) und in erwachsenen SGs im Vergleich zu ganzen Individuen exprimiert und angereichert werden.

Abbildung 1: f-Agdsx und fkh Knockdown bei erwachsenen An. gambiae reduziert die fkh-mRNA-Spiegel in den SGs und beeinflusst die Fähigkeit der Frau, sich mit Blut zu ernähren. (A) Repräsentatives Bild des Plasmiddesigns, das für die dsRNA-Produktion in dieser Methodik verwendet wird. Die zweite T7-Promotorsequenz wird dem Plasmid hinzugefügt, indem es in den 3'-Primer aufgenommen wird, der verwendet wird, um das zu klonende Insert in das pGEMT-Plasmid zu verstärken. Das Plasmid wird dann in E. coli HT115 (DE3) Bakterien umgewandelt und eine Fütterungslösung wird aus einer Suspension von induzierten wärmeabgetöteten Bakterien in 10% Zuckerwasser hergestellt. (B) Tiere, die mit einer dsRNA-Fütterungslösung für f-Agdsx oder fkh gefüttert wurden, zeigten signifikant niedrigere Konzentrationen von fkh-Transkripten (Einweg-ANOVA mit mehreren Vergleichen; n = 15). Allerdings zeigte nur die Gruppe, die mit fkh dsRNA (C) gefüttert wurde, einen signifikanten Unterschied in der Anzahl der Beißversuche, die benötigt wurden, um eine Blutmahlzeit zu erhalten. Moskitos in dieser Gruppe benötigten im Durchschnitt die fünffache Anzahl von Sondierungsversuchen, um eine erfolgreiche Blutmahlzeit zu erhalten, als von der Kontrolle oder den mit dsx-dsRNA gefütterten Gruppen benötigt wurde (Einweg-ANOVA mit mehreren Vergleichen; n = 15). Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) an. Jedes Experiment wurde in drei separaten biologischen Replikaten durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: fkh-Knockdown bei erwachsenen An. gambiae-Speicheldrüsen reduziert den SG-Transkriptionsfaktor. Gezeigt werden repräsentative Bilder von Tag 13 erwachsenen weiblichen An. gambiae SGs nach 8 Tagen (Tage 5-13) oraler Exposition gegenüber entweder (A) nicht verwandter dsRNA-Kontrolle (Ameise) oder (B) dsRNA, die auf den SG TF-Gabelkopf (fkh, AGAP001671) in 10% Saccharose mit den Farbstoffen DAPI (DNA; rot), markiertem Weizenkeimagglutinin (WGA, Chitin / O-GlcNAcylation; blau) abzielt, Antiseren gegen die SG TFs Sage (grün) und CrebA (lila). Die angegebenen Maßstabsleistenlängen sind Mikrometer. SGs (i) sind mit weißen Bindestrichen umrandet. Gelbe Linien in gezoomten Lappenbildern (von den Regionen, die von gelben Kästchen umgeben und mit "Inset" beschriftet sind) zeigen an, wo die Zeilenscans der Signalintensität durchgeführt wurden. Grüne und violette Kanalintensitäten, die den Zeilenscans für jeden gezoomten Lappen entsprechen, werden in den Diagrammen unter den Bildern (immer von links nach rechts im SG) dargestellt; X-Achse = Abstand (in Pixel) und Y-Achse = Graueinheit (Pixelintensität). Der Dynamikumfang der Pixelintensität wird durch rote (Maximum) und blaue (Minimum) gepunktete Linien begrenzt, und die entsprechenden Werte werden in jedem Diagramm angezeigt. MIP = maximale Intensität 3D-Projektion durch die gesamte SG-Tiefe. DL: distaler Seitenlappen; M: Medialappen; PL: proximaler Seitenlappen; SD: Speichelgang. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: fkh knockdown bei erwachsenen An. gambiae Speicheldrüsen reduziert SG sezernierte Proteinspiegel. Gezeigt werden repräsentative Bilder von Tag 13 erwachsenen weiblichen An. gambiae SGs nach 8 Tagen (Tage 5-13) oraler Exposition gegenüber entweder (A) nicht verwandter dsRNA-Kontrolle (Ameise) oder (B) dsRNA, die auf den SG TF-Gabelkopf (fkh, AGAP001671) abzielt, in 10% Saccharose, angefärbt mit den Farbstoffen DAPI (DNA; rot), markiertem Weizenkeimagglutinin (WGA, Chitin / O-GlcNAcylation; blau), und die Speichelproteine AAPP (grün) und Mucin (MUC2, lila). Die angegebenen Maßstabsleistenlängen sind Mikrometer. SGs (i) sind mit weißen Bindestrichen umrandet. Gelbe Linien in gezoomten Lappenbildern (der von gelben Kästchen umschlossenen Regionen) zeigen an, wo die Zeilenscans der Signalintensität durchgeführt wurden. Grüne und violette Kanalintensitäten, die den Linienscans für jeden Lappen entsprechen, werden in den Diagrammen unter den Bildern (immer von links nach rechts im SG) dargestellt; X-Achse = Abstand (in Pixel) und Y-Achse = Graueinheit (Pixelintensität). Der Dynamikumfang der Pixelintensität wird durch rote (maximale) und blaue (minimal) gestrichelte Linien begrenzt, und die entsprechenden Werte werden in jedem Diagramm angezeigt. MIP = maximale Intensität 3D-Projektion durch die gesamte SG-Tiefe. DL: distaler Seitenlappen; M: Medialappen; PL: proximaler Seitenlappen; SD: Speichelgang. Kursive "DL"-Beschriftungen (Bi) kennzeichnen zwei sichtbare Bereiche desselben DL-Lappens. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: fkh knockdown bei erwachsenen An. gambiae Speicheldrüsen reduziert SG-Sekretionsmarker. Gezeigt werden repräsentative Bilder von Tag 13 erwachsenen weiblichen An. gambiae SGs nach 8 Tagen (Tage 5-13) oraler Exposition gegenüber entweder (A) nicht verwandter dsRNA-Kontrolle (Ameise) oder (B) dsRNA, die auf den SG TF-Gabelkopf (fkh, AGAP001671) in 10% Saccharose gerichtet ist, die mit den Farbstoffen DAPI (DNA; rot), markiertem Weizenkeimagglutinin (WGA, Chitin / O-GlcNAcylation; blau) gefärbt ist. Nilrot (Lipide; lila) und Antiseren gegen den Recycling-Endosomen-Vesikelmarker Rab11 (grün). Die angegebenen Maßstabsleistenlängen sind Mikrometer. SGs (i) sind mit weißen Bindestrichen umrandet. Gelbe Linien in gezoomten Lappenbildern (der von gelben Kästchen umschlossenen Regionen) zeigen an, wo die Zeilenscans der Signalintensität durchgeführt wurden. Grüne und violette Kanalintensitäten, die den Linienscans für jeden Lappen entsprechen, werden in den Diagrammen unter den Bildern (immer von links nach rechts im SG) dargestellt; X-Achse = Abstand (in Pixel) und Y-Achse = Graueinheit (Pixelintensität). Der Dynamikumfang der Pixelintensität wird durch rote (maximale) und blaue (minimal) gestrichelte Linien begrenzt, und die entsprechenden Werte werden in jedem Diagramm angezeigt. MIP = maximale Intensität 3D-Projektion durch die gesamte SG-Tiefe. DL: distaler Seitenlappen; M: Medialappen; PL: proximaler Seitenlappen; SD: Speichelgang. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Diskussion

Die Fähigkeit, dsRNA effektiv an An. gambiae-Mücken durch orale Fütterung zu liefern, hat weitreichende Auswirkungen auf Studien der Vektorbiologie sowohl im Labor als auch im Feld. Die Mikroinjektion ist seit langem als bevorzugte Art der Verabreichung von Chemikalien, Antikörpern, RNAi und genetischen Modifikationsstrategien bei Moskitos^{akzeptiert 43,44}. Die Folgen erheblicher physischer Manipulationen, Zellschäden und Stress können durch die Verwendung einer mündlichen Verabreichung vermieden werden, die möglicherweise auch für Groß- oder Feldanwendungen geeignet sein könnte. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass RNAi innerhalb einer einzelnen erwachsenen Mücke²⁹ allgegenwärtig wirkt und Wirkungen in allen Geweben, einschließlich der Speicheldrüsen, ermöglicht. Durch die Fütterung von Moskitos mit einer großen Anzahl von dsRNA-exprimierenden E. coli, die über einen langen Zeitraum asynchron verdaut werden, kann man möglicherweise eine konsistente und einheitliche Exposition gegenüber der RNAi bei allen Individuen in einem Käfig erreichen. Diese Methode ermöglicht es, eine große Anzahl von Moskitos zu füttern und die potenzielle Variabilität der resultierenden Phänotypen in Abhängigkeit vom Zielgen zu analysieren. Eine wichtige Überlegung ist jedoch die Möglichkeit einer heterogenen Verteilung der Bakterien und damit der dsRNA in der Baumwollfaser. Die 400 μL Bakterien, die täglich für die Zuckerfütterung von Mücken verwendet werden, würden ungefähr ≤4,6 μg dsRNA enthalten, wie zuvor beschrieben und berechnet 9, aber die Menge an dsRNA, die von jeder Mücke aufgenommen wurde^, wurde nicht individuell bestimmt. Wenn der Aufbau von dsRNA-Konstrukten zur Routine wird, ermöglicht dieses einfache Behandlungsprotokoll eine schnelle Assimilation dieser Technik durch jeden Mückenforscher. A priori ist der Zeitaufwand während der Behandlung (30 Minuten pro Tag) im Vergleich zu der Zeit, die benötigt wird, um die Mikroinjektion auf ähnliche Probengrößen zu erlernen und anzuwenden, trivial.

Die Fütterung von dsRNA wird routinemäßig für umgekehrte genetische Studien im Modellorganismus Caenorhabditis elegans⁴⁵ verwendet. Dieser starke Nutzungsgrad unterstreicht den Wert des mündlichen Vortragsansatzes. Der Bau einer genomweiten Bibliothek von An. gambiae in transformiertem E. coli, ähnlich der, die in C. elegans^46,47 existiert, würde ein schnelles umgekehrtes genetisches Screening bei Moskitos in erhöhtem Umfang ermöglichen. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Effizienz der Methode in hohem Maße von den endogenen Transkriptspiegeln abhängt und wenn die Expression nicht auf das Zielgewebe beschränkt ist, sondern breiter ausgedrückt^wird 4,8,44. Darüber hinaus gibt es Hinweise darauf, dass einige Insektizide die Verhaltensvermeidung von Moskitos⁴⁸ induzieren könnten, und die Fütterung mit Bakterien, die möglicherweise nachteilige Auswirkungen auf sie haben, könnte ähnliche Vermeidungsmuster auslösen. In der kontrollierten Umgebung des Labors, wo die Moskitos keine alternative Nahrungsquelle hatten, hatten sie keine Wahl, das Zuckerwasser mit E. coli zu vermeiden, und die Notwendigkeit einer nahrhaften Quelle würde wahrscheinlich den Instinkt außer Kraft setzen, die Bakterien zu vermeiden. Dies sollte jedoch in Betracht gezogen werden, wenn die Strategie in weniger kontrollierten Umgebungen verwendet werden sollte.

Es kann möglich sein, mehrere Gene gleichzeitig ins Visier zu nehmen (mit einem Konstrukt, mehreren Konstrukten oder einer Mischung aus transformierten Bakterienisolaten), aber weitere Studien sind erforderlich, um die Wirksamkeit zu bewerten. Eine weitere wichtige Überlegung zu diesem Punkt ist die Bewertung möglicher Off-Target- oder Synergieeffekte bei Verwendung einzelner oder mehrerer Targets. Die Etablierung geeigneter Kontrollgene und -gruppen ist ein wichtiger Bestandteil des Versuchsdesigns. Darüber hinaus ist es verlockend zu spekulieren, dass dieser Ansatz verwendet werden könnte, um andere Krankheitserreger oder Viren anzugreifen⁴⁹. Frühere Arbeiten zur RNAi-Induktion bei Moskitos wurden unter Bedingungen durchgeführt, unter denen das Reagenz direkt injiziert wurde, so dass E. coli nicht vorhanden waren. Die E. coli können ein Schutzkompartiment bilden, das die langsamere Freisetzung von dsRNA im Laufe der Zeit ermöglicht, wodurch sichergestellt wird, dass die Exposition über einen viel längeren Zeitraum mehr oder weniger kontinuierlich ist²⁹.

Schließlich zeigen diese Ergebnisse, dass die Auswirkungen dieser Technik durch Anpassung des Zeitrahmens (Länge und Starttag) der Exposition und der Menge der verwendeten E. coli abstimmbar sind. Diese Eigenschaft ermöglichte es uns, die Funktionen essentieller Gene (dsx und fkh) zu untersuchen, indem wir optimale Knockdown-Bedingungen durch Versuch und Irrtum identifizierten. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass Zielgene von Interesse mit dieser Technik untersucht werden können, erheblich.

Zusammenfassend wurde festgestellt, dass die orale Abgabe von RNAi an erwachsene Moskitos einfach, vielseitig und ein leistungsfähiger Ansatz zur Untersuchung der Genfunktion von Mücken und zur Schaffung neuartiger und formbarer Werkzeuge zur Vektorkontrolle von durch Mücken übertragenen Krankheiten sein kann.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Kb Plus DNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	10787018
2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) Medium	BD Difco	DF0440-17
AAPP	n/a	n/a	Antisera. 1:50 dilution (rabbit); gift from Fabrizio Lombardo
AccuStart II PCR Supermix	Quantabio	95137-100
Agarose	Millipore Sigma	A9539
Ampicillin	Millipore Sigma	A5354
Anopheles gambiae G3	BioDefense and Emerging Infections (BEI) Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4)	MRA-112
BugDorm	BioQuip	1452
Centrifuge 5810R	Eppendorf	P022628181
CrebA	DSHB	CrebA Rbt-PC	Antisera. 1:50 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab
Damiens diet	BioServ
DAPI	Life Technologies	n/a	4′,6-diamidino-2-phenylindole; 1:200 dilution.
Defibrinated sheep blood	HemoStat	DSB050
Escherichia coli HT115 (DE3)
Ethidium bromide	Millipore Sigma	E7637
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific	4368814
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Millipore Sigma	I5502
JM109 Competent cells	Promega	L2005
Luria Broth Media	Thermo Fisher Scientific	10855001
Mucin 2	Proteintech	Muc2; 27 675-1-AP	Antisera. 1:100 dilution (mouse).
Nanodrop 2000	Thermo Fisher Scientific
Nile Red	Sigma	n/a	Lipid dye; 1:50 dilution.
Owl EasyCast B2 Mini Gel Horizontal Electrophoresis	Thermo Fisher Scientific	Model B2
pGEMT easy	Promega	A3600
Power SYBR-green PCR master MIX	Applied Biosystems	4367659
PureLink PCR purification kit	Thermo Fisher Scientific	K31001
QuantaStudio 6	Applied Biosystems
QuantStudio6 Real Time PCR System	Applied Biosystems
Rab11	n/a	n/a	Antisera. 1:100 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab
Rh-WGA	Vector Labs	n/a	Rhodamine-conjugated wheat germ agglutinin (chitin, O-GlcNAcylation dye); 1:40 dilution
Sage	n/a	n/a	Antisera. 1:50 dilution (rat); generated by the Andrew Lab
T4 DNA ligase	Promega	M1801
Tetracycline	Millipore Sigma	87128
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596018
Zeiss LSM700 fluorescence confocal microscope	Zeiss
ANTIBODIES
Chicken anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A21472
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A28181
IgG (H+L) Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A27034
Rabbit anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A27012
PRIMERS
ACT-2f: TACAACTCGATCATGAAGTGCGA	CDC Biotechnology Core Facility Branch	n/a	qRT-PCR primer
ACT-3r: CCCGGGTACATGGTGGTACCGC CGGA	CDC Biotechnology Core Facility Branch	n/a	qRT-PCR primer
FKH_RNAi_F: GCCGACTTATGCTTAGCCCA	CDC Biotechnology Core Facility Branch	n/a	qRT-PCR primer
FKH_RNAi_R: TAGCCGTCAATTCCTCCTGC	CDC Biotechnology Core Facility Branch	n/a	qRT-PCR primer
newDSX-f: AGAGGGCGGGGAAATTCTAGT	CDC Biotechnology Core Facility Branch	n/a	qRT-PCR primer
newDSX-r: GGGCTTGTGGCAGTACGAATA	CDC Biotechnology Core Facility Branch	n/a	qRT-PCR primer
S7qf1: AGAACCAGCAGACCACCATC	CDC Biotechnology Core Facility Branch	n/a	qRT-PCR primer
S7qr1: GCTGCAAACTTCGGCTATTC	CDC Biotechnology Core Facility Branch	n/a	qRT-PCR primer