Gepooltes shRNA-Bibliotheksscreening zur Identifizierung von Faktoren, die einen Phänotyp der Arzneimittelresistenz modulieren

Zusammenfassung

Das RNAi-Screening (High-Throughput-RNA-Interferenz) unter Verwendung eines Pools lentiviraler shRNAs kann ein Werkzeug sein, um therapeutisch relevante synthetische tödliche Ziele in Malignomen nachzuweisen. Wir bieten einen gepoolten shRNA-Screening-Ansatz zur Untersuchung der epigenetischen Effektoren bei akuter myeloischer Leukämie (AML).

Zusammenfassung

Das Verständnis klinisch relevanter Treibermechanismen der erworbenen Chemoresistenz ist entscheidend für die Aufklärung von Möglichkeiten zur Umgehung von Resistenzen und zur Verbesserung des Überlebens bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML). Ein kleiner Teil der leukämischen Zellen, die eine Chemotherapie überleben, haben einen ausgeglichenen epigenetischen Zustand, um chemotherapeutische Beleidigungen zu tolerieren. Eine weitere Exposition gegenüber einer Chemotherapie ermöglicht es diesen Wirkstoffpersisterzellen, einen festen epigenetischen Zustand zu erreichen, der zu einer veränderten Genexpression führt, was zur Proliferation dieser arzneimittelresistenten Populationen und schließlich zu einem Rückfall oder einer refraktären Erkrankung führt. Daher ist die Identifizierung epigenetischer Modulationen, die das Überleben arzneimittelresistenter leukämischer Zellen erfordern, von entscheidender Bedeutung. Wir beschreiben ein Protokoll zur Identifizierung epigenetischer Modulatoren, die die Resistenz gegen das Nukleosidanalog-Cytarabin (AraC) vermitteln, indem wir ein gepooltes shRNA-Bibliotheksscreening in einer erworbenen Cytarabin-resistenten AML-Zelllinie verwenden. Die Bibliothek besteht aus 5.485 shRNA-Konstrukten, die auf 407 humane epigenetische Faktoren abzielen, was ein epigenetisches Faktor-Screening mit hohem Durchsatz ermöglicht.

Einleitung

Die therapeutischen Optionen bei akuter myeloischer Leukämie (AML) sind in den letzten fünf Jahrzehnten unverändert geblieben, wobei Cytarabin (AraC) und Anthrazykline die Eckpfeiler für die Behandlung der Krankheit sind. Eine der Herausforderungen für den Erfolg der AML-Therapie ist die Resistenz von leukämischen Stammzellen gegen Chemotherapie, was zu einem Krankheitsrückfall führt ^1,2. Die epigenetische Regulation spielt eine entscheidende Rolle bei der Krebspathogenese und Arzneimittelresistenz, und mehrere epigenetische Faktoren haben sich als vielversprechende therapeutische Ziele^heraus....

Protokoll

Befolgen Sie die Richtlinien des Institutional Biosafety Committee (IBSC) und nutzen Sie die richtige Einrichtung, um mit Lentivirus (BSL-2) umzugehen. Das Personal sollte in angemessener Weise im Umgang mit und der Entsorgung von Lentiviren geschult werden. Dieses Protokoll folgt den Biosicherheitsrichtlinien des Christian Medical College, Vellore.

1. Auswahl des potentesten Promotors, um eine persistente und verlängerte Expression der shRNAs zu erhalten

HINWEIS: Es ist wichtig, ein Transduktionsexperiment mit lentiviralen Vektoren mit verschiedenen Promotoren durchzuführen, die Fluoreszenzprotein....

Ergebnisse

Der gesamte Screening-Workflow ist in Abbildung 1A dargestellt. Die In-vitro-Zytotoxizität des MV4-11 AraC R (48 h) zeigte, dass der IC50 zu Cytarabin im MV4-11 AraC R höher war als der MV4-11 P (Abbildung 1B). Diese Zelllinie wurde in der Studie als Modell für das Screening der epigenetischen Faktoren verwendet, die für die Cytarabinresistenz verantwortlich sind.

Abbildung 2A

Diskussion

RNA-Interferenz (RNAi) wird in großem Umfang für funktionelle Genomik-Studien verwendet, die siRNA- und shRNA-Screening umfassen. Der Vorteil von shRNA besteht darin, dass sie in Plasmidvektoren eingebaut und in genomische DNA integriert werden können, was zu einer stabilen Expression und damit zu einem längeren Knockdown der Ziel-mRNA führt. Ein gepooltes shRNA-Bibliotheksscreening ist im Vergleich zu den herkömmlichen Array-Screens (siRNA) robust und kostengünstig. Die Identifizierung der Wesentlichkeit einer be.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
100 bp Ladder Hyper Ladder	BIOLINE	BIO-33025
1kb Ladder Hyper Ladder	BIOLINE	BIO-33056
Agarose	Lonza Seachekm	50004
Betaine (5mM)	Sigma	B03001VL
Boric Acid	Qualigens	12005
Cell culture plasticware	Corning	as appicable
Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride	Sigma	C1768-500MG
DMEM	MP BIO	91233354
DMSO	Wak Chemie GMBH	Cryosure DMSO 10ml
EDTA	Sigma	E5134
Ethidium Bromide	Sigma	E1510-10 mL
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000044
Gel/PCR Purification Kit	MACHEREY-NAGEL	REF 740609.50
Gibco- RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	23400021
Glacial Acetic Acid	Thermo	Q11007
hCMV GFP Plasmid	Transomics	TransOmics Promoter selection KIT
hEF1a GFPlasmid	Transomics	TransOmics Promoter selection KIT
HEK 293T	ATCC	CRL-11268
HL60 cell line	ATCC	CCL-240
KOD Hot Start Polymerase	Merck	71086
Molm13 cell line	Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA	Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA
MV4-11 cell line	ATCC	CRL-9591
Penicillin streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
psPAX2 and pMD2.G	Addgene	Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	REF Q32854
SFFV  GFP Plasmid	Transomics	TransOmics Promoter selection KIT
shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics	Transomics	Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14
Trans-IT-LTI Mirus	Mirus	Mirus Catalog Number: MIR2300
Tris	MP Biomedicals	0219485591
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154-100ML
Ultra centrifuge Tubes	Beckman Coulter	103319
Equipments
5% CO2 incubator	Thermo Fisher
BD Aria III cell sorter	Becton Dickinson
Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation	Beckman coulter
Centrifuge	Thermo Multiguge 3SR+
ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system)	Fluro Chem
Leica AF600	Leica
Light Microscope	Zeiss Axiovert 40c
Nanodrop	Thermo Scientific
Qubit 3.0 Fluorometer	Invitrogen
Thermal Cycler	BioRad