Kokultur von murinen Dünndarm-Epithelorganoiden mit angeborenen lymphatischen Zellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet detaillierte Anweisungen zur Etablierung von murinen Dünndarmorganoiden, zur Isolierung angeborener Lymphzellen des Typs 1 aus der murinen Dünndarmlamina propria und zur Etablierung von 3-dimensionalen (3D) Kokulturen zwischen beiden Zelltypen, um bidirektionale Wechselwirkungen zwischen Darmepithelzellen und angeborenen lymphatischen Typ-1-Zellen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Komplexe Co-Kulturen von Organoiden mit Immunzellen bieten ein vielseitiges Werkzeug, um die bidirektionalen Wechselwirkungen zu hinterfragen, die das empfindliche Gleichgewicht der Schleimhauthomöostase untermauern. Diese multizellulären 3D-Systeme bieten ein reduktionistisches Modell für die Behandlung multifaktorieller Erkrankungen und die Lösung technischer Schwierigkeiten, die bei der Untersuchung seltener Zelltypen wie geweberesidenten angeborenen lymphatischen Zellen (ILCs) auftreten. Dieser Artikel beschreibt ein murines System, das Dünndarmorganoide und von Dünndarmlamina propria abgeleitete helferähnliche Typ-1-ILCs (ILC1s) kombiniert, die leicht auf andere ILC- oder Immunpopulationen ausgedehnt werden können. ILCs sind eine gewebeansässige Population, die besonders in der Schleimhaut angereichert ist, wo sie die Homöostase fördern und schnell auf Schäden oder Infektionen reagieren. Organoide Co-Kulturen mit ILCs haben bereits begonnen, neue epitheliale Immunsignalmodule im Darm zu beleuchten und zu zeigen, wie verschiedene ILC-Untergruppen die Integrität und Regeneration der Darmepithelbarriere beeinflussen. Dieses Protokoll wird weitere Untersuchungen über reziproke Wechselwirkungen zwischen Epithel- und Immunzellen ermöglichen, die das Potenzial haben, neue Einblicke in die Mechanismen der Schleimhauthomöostase und -entzündung zu liefern.

Einleitung

Die Kommunikation zwischen dem Darmepithel und dem darmresidenten Immunsystem ist für die Aufrechterhaltung der Darmhomöostase von zentraler Bedeutung¹. Störungen dieser Wechselwirkungen sind sowohl mit lokalen als auch mit systemischen Erkrankungen verbunden, einschließlich entzündlicher Darmerkrankungen (IBD) und Magen-Darm-Krebs². Ein bemerkenswertes Beispiel für einen kürzlich beschriebenen kritischen Regulator der Homöostase stammt aus der Untersuchung angeborener lymphatischer Zellen (ILCs), die sich als Schlüsselfiguren in der intestinalen Immunlandschaft^{herauskristallisiert haben 3}. ILCs s....

Protokoll

Alle Versuche müssen in Übereinstimmung mit allen relevanten regulatorischen und institutionellen Richtlinien für die Tiernutzung durchgeführt werden. Die ethische Genehmigung für die im folgenden Artikel und Video beschriebene Studie wurde in Übereinstimmung mit allen relevanten regulatorischen und institutionellen Richtlinien für die Tiernutzung eingeholt.

Alle Mäuse wurden durch Zervixdislokation nach dem ethischen Standardverfahren gekeult, das von geschulten Personen durchgeführt wurde. Vor der Organ- und Gewebeentnahme wurde das Schneiden der Oberschenkelarterie oder die Enthauptung (entsprechend dem vorliegenden Protokoll) als bestät....

Ergebnisse

Nach erfolgreichem Abschluss sollten frisch isolierte Krypten innerhalb von 2-4 Tagen knospende Kryptenstrukturen bilden (Abbildung 1A). Gesunde und robuste Organoidkulturen sollten aktiv wachsen und können wie im Protokoll beschrieben durchlaufen und erweitert werden.

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Dünndarm-ILC1 aus der RORγt^GFP murine transgenen Reporterlinie, die die Isolierung von lebendem ILC1 durch FACS erm?.......

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die Methoden zur Etablierung von murinen Dünndarmorganoiden, zur Isolierung seltener ILC1 durch Minimierung des Verlusts von Lymphozyten während des intestinalen Dissoziationsprotokolls und zur Etablierung von Kokulturen zwischen diesen beiden Kompartimenten. Es gibt viele Schritte zu diesem Protokoll, und während einige spezifisch für ILC1s sind, kann dieser Ansatz auf andere intestinale Immunzelltypen angewendet werden, und Co-Kultur-Setups können modular an individuelle Forschungsfrage.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
Anti-mouse CD45 (BV510)	BioLegend	103137
Anti-mouse NK1.1 (PE)	Thermo Fisher Scientific	12-5941-83
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044
CD127 Monoclonal Antibody (APC)	Thermo Fisher Scientific	17-1271-82
CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450)	Thermo Fisher Scientific	48-0193-82
CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450)	Thermo Fisher Scientific	48-0051-82
CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450)	Thermo Fisher Scientific	48-0031-82
CHIR99021	Tocris	4423/10
COLLAGENASE D, 500MG	Merck	11088866001
Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells	Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University)
DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II)	Merck	4942078001
DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12)	Gibco	11320033
DNASE I, GRADE II	Merck	10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X)	Gibco	21969-035
Ethilenediamine Tetraacetate Acid	Thermo Fisher Scientific	BP2482-100
FC block	2B Scientific	BE0307
Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated	Gibco	10500064
GlutaMAX (100X)	Gibco	3050-038
Hanks' Balanced Salt Solution (10X)	Gibco	14065056
HBSS (1X)	Gibco	12549069
HEK-293T- mNoggin-Fc Cells	Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012).
HEPES Buffer Solution (1M)	Gibco	15630-056
KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710)	Thermo Fisher Scientific	46-5893-82
Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	Thermo Fisher Scientific	L23105
Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450)	Thermo Fisher Scientific	48-5931-82
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free	Corning	356231
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048
N-acetylcysteine (500mM)	Merck	A9165
NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7)	Thermo Fisher	25-3351-82
PBS (1 X) 7.2 pH	Thermo Fisher Scientific	12549079
PBS (10X)	Gibco	70013032
Percoll	Cytiva	17089101
Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein	R&D Systems	AFL236
Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF	R&D Systems	247-GMP
Recombinant Human IL-2 (carrier free)	BioLegend	589106
Recombinant Mouse IL-7 (carrier free)	R&D Systems	407-ML-005/CF
UltraComp eBeads	Thermo Fisher Scientific	01-2222-42
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)	Bio-techne	1254
Plastics
50 mL tube	Falcon	10788561
1.5 mL tube	Eppendorf	30121023
10 mL pippette	StarLab	E4860-0010
15 mL tube	Falcon	11507411
25 mL pippette	StarLab	E4860-0025
p10 pippette tips	StarLab	S1121-3810-C
p1000 pippette tips	StarLab	I1026-7810
p200 pippette tips	StarLab	E1011-0921
Standard tissue culture treated 24-well plate	Falcon	353047
Equipment
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
CO2 and temperature controled incubator	Eppendorf	Galaxy 170 R/S
Flow Assisted Cellular Sorter	BD equipment	FACS Aria II
Heated shaker	Stuart Equipment	SI500
Ice box	-	-
Inverted light microscope	Thermo Fisher Scientific	EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)
p10 pippette	Eppendorf	3124000016
p1000 pippette	Eppendorf	3124000063
p200 pippette	Eppendorf	3124000032
Pippette gun	Eppendorf	4430000018
Wet ice	-	-