Methodik zum Testen von Kontrollmitteln und Insektiziden gegen den Kaffeebeerenzünsler Hypothenemus hampei

Zusammenfassung

Eine Methode mit grünen Kaffeefrüchten (GFs) wurde entwickelt, um die Toxizität von Insektiziden gegen den Kaffeebeerenzünsler (CBB) zu testen. Insektizide oder toxische Substanzen wurden vor oder nach dem CBB-Befall auf desinfizierte GFs aufgetragen. Insektensterblichkeit, Abwehr und Fortpflanzungsfähigkeit wurden neben anderen Parametern bewertet.

Zusammenfassung

Bevor Insektizide zur Behandlung des Kaffeebeerenzünslers (CBB) Hypothenemus hampei empfohlen werden, ist es wertvoll, die Mortalität und Abwehr dieser Insektizide gegen erwachsene Insekten oder ihre Auswirkungen auf die Fortpflanzungsleistung zu kennen. Die derzeit verfügbaren Methoden bewerten jedoch nur die Erwachsenensterblichkeit, wodurch die Auswahl neuartiger Insektizide mit einer anderen Wirkungsweise eingeschränkt wird. In dieser Arbeit wurden verschiedene experimentelle Methoden untersucht, um die vielfältigen Effekte auf die CBB unter Laborbedingungen zu identifizieren. Dazu wurden grüne Kaffeefrüchte (GFs) gesammelt und durch Eintauchen in Natriumhypochloritlösung mit anschließender UV-Lichtbestrahlung desinfiziert. Parallel dazu wurden CBB-Erwachsene aus einer Kolonie durch Eintauchen in Natriumhypochloritlösung desinfiziert. Um den Fruchtschutz (Vorbefall) zu beurteilen, wurden die Früchte in Plastikboxen gelegt und die Insektizide aufgetragen. Dann wurden die CBB-Erwachsenen mit einer Rate von zwei CBBs pro GF freigelassen. Die GFs wurden unter kontrollierten Bedingungen gelassen, um den CBB-Befall und das Überleben nach 1, 7, 15 und 21 Tagen zu bewerten. Um die Wirksamkeit von Insektiziden nach CBB-Befall (Postbefall) zu bewerten, wurden CBB-Erwachsene in einem Verhältnis von 2:1 für 3 h bei 21 °C in die GFs freigesetzt. Befallene Früchte, die CBB-Erwachsene mit teilweise exponiertem Bauch zeigten, wurden ausgewählt und in 96-Well-Racks gelegt, und die CBBs, die sich in die Früchte bohrten, wurden direkt behandelt. Nach 20 Tagen wurden die Früchte seziert und die biologischen CBB-Stadien in jeder Frucht aufgezeichnet. Die GFs dienten als Substrate, die natürliche Bedingungen nachahmen, um toxische, chemische und biologische Insektizide gegen die CBB zu bewerten.

Einleitung

Der Kaffeebeerenzünsler (CBB), Hypothenemus hampei, wurde erstmals 1988 in Kolumbien nachgewiesen und hat sich seitdem zur wichtigsten Schädlingsart der Kaffeeernte entwickelt. CBB-Weibchen verlassen die Geburtsfrucht bereits befruchtet und suchen nach neuen Früchten, die von den flüchtigen Chemikalien geleitet werden, die sie emittieren ^1,2. Ein kompletter Zyklus wird innerhalb von 23 Tagen³ bei einer Temperatur von 25 °C erfüllt. Der Zyklus beginnt damit, dass das Gründerweibchen in den Samen eindringt und Eier in das Fruchtendosperm legt. Die eingeschlossenen Larven fressen den Samen. Wenn die Früchte an dieser Stelle seziert werden, wäre es möglich, sowohl das Gründerweibchen als auch ihre Nachkommen zu beobachten. Nach 14 Tagen werden die Larven zu Puppen - im Allgemeinen dauert das Puppenstadium 5 Tage. Im Erwachsenenstadium kopulieren die Weibchen mit ihren Geschwistern, und die neu befruchteten Weibchen fliegen von den beschädigten Früchten weg und suchen nach neuen Kaffeefrüchten, um einen neuen Zyklus^{zu beginnen 4}.

Sowohl der Penetrationsprozess als auch das Ergebnis der Larvenfütterung schädigen das Kaffeesamen, verringern die Qualität des Kaffeegetränks und verringern den Umsatz erheblich. Ein Befall von mehr als 5% in Kaffeeplantagen gilt allgemein als wirtschaftliche Schwelle.

Die CBB-Bekämpfung basiert auf einer integrierten Schädlingsbekämpfungsstrategie (IPM), die kulturelle Kontroll- und agronomische Praktiken, natürliche biologische Arbeitsstoffe und den Einsatz chemischer Insektizide umfasst, was Sicherheitsbedingungen und eine rechtzeitige Anwendung^{erfordert 4}.

Um neue Insektizide für die Bekämpfung der CBB zu evaluieren, sind kostengünstige Methoden erforderlich, die schnelle Ergebnisse ermöglichen. Derzeit werden sowohl Labor- als auch Feldverfahren verwendet, einschließlich künstlicher Diäten, die Kaffee enthalten, in denen die Insektizide enthalten^{sind 5,6}, oder das Versprühen der Insektizide auf trockenen Pergamentkaffee 7,8,9. Darüber hinaus wurden Experimente im Feld mit Kaffeebaumzweigen, die mit entomologischen Hülsen bedeckt waren, berichtet^10,11; Diese Methoden erfordern jedoch intensive Arbeit und lange Evaluierungszeiträume.

Ein Zustand, der natürlichen Feldbedingungen ähnelt und ebenfalls schnell und kostengünstig ist, ist die Verwendung von grünen oder reifen Kaffeefrüchten. Diese Früchte müssen jedoch unter Bedingungen erhalten bleiben, die für die Entwicklung der CBB geeignet sind, wobei Veränderungen und Verunreinigungen durch Mikroorganismen vermieden werden, um ihre Qualität und Eigenschaften zu erhalten. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Desinfektionsmittel sowie Verfahren mit Wärme und Strahlung 7,9,12,13,14,15,16 verwendet.

Darüber hinaus erfordern die Methoden zur Insektizidbewertung gegen die CBB Simulationen von erwachsenen Weibchen, die auf der Suche nach Früchten fliegen oder in diese Früchte eindringen^17,18. Zu diesem Zweck wurde auf dem Feld 8,11,19 ein künstlicher Fruchtbefall durchgeführt^, obwohl dieser Prozess arbeitsintensiv ist und von den Umweltbedingungen abhängt.

Hier beschreiben wir eine standardisierte Methodik zur Bewertung von Produkten, die unter kontrollierten Umgebungsbedingungen, die Feldbedingungen ähneln, unterschiedliche Auswirkungen auf die CBB haben können.

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Protokoll

HINWEIS: Dieses Protokoll befasst sich mit verschiedenen Methoden, um verschiedene Auswirkungen auf die CBB unter Laborbedingungen zu identifizieren.

1. Obstsammlung

1. Pflücken Sie GFs mit einem Entwicklungsalter von ~ 120-150 Tagen nach der Blüte von Bäumen in einer Kaffeeplantage am frühen Morgen.

2. Obstdesinfektion²⁰

1. Bringen Sie rund 300 GFs ins Labor. Wählen Sie gleichmäßig große und gesunde GFs und ziehen Sie die Stiele zurück.
2. Tauchen Sie die GFs in eine Seifenlösung (2 ml flüssige Spülmittel in 998 ml Leitungswasser), gefolgt von Reiben, um die GFs zu waschen. Dann spülen Sie die Früchte mit Wasser ab und wechseln Sie das Wasser dreimal.
3. GFs in 0,5% ige Natriumhypochloritlösung (100 ml in 900 ml Leitungswasser) tauchen und 15 min in einem Shaker bei 110 U/min umrühren. Dann spülen Sie die GFs mit Wasser ab, indem Sie in einem Shaker umrühren und das Wasser dreimal alle 10 Minuten wechseln.
4. Trocknen Sie die GFs mit sterilen Papiertüchern.
5. Legen Sie die GFs in Schalen (33 cm x 25 cm x 2 cm) und bestrahlen Sie sie 15 Minuten lang, wobei Sie die GFs in einem Abstand von 55 cm von der UV-Quelle in einer UV-fähigen horizontalen Laminar-Flow-Station platzieren.
6. Bewegen Sie während der 15-minütigen Periode alle 5 Minuten die GFs, um die Bestrahlung der gesamten Frucht sicherzustellen.

3. Insektendesinfektion²¹

1. Verwenden Sie neu aufgetauchte (am selben Tag) CBB-Insekten, um die Bioassays einzurichten.
2. Tauchen Sie die CBBs in 0,5% ige Natriumhypochloritlösung und rühren Sie sie langsam mit einer Bürste für 10 min.
3. Filtern Sie die CBBs durch ein Musselintuch und waschen Sie sie dreimal mit sterilem destilliertem Wasser.
4. Entfernen Sie überschüssiges Wasser mit sterilen Papiertüchern.

4. Bewertung eines Produktes mit schützender Wirkung auf die Früchte (Vorbefall) (Abbildung 1)

1. Verwenden Sie eine Gruppe von GFs pro Versuchseinheit. Im Allgemeinen wird eine Gruppe von 30 GFs pro Versuchseinheit verwendet.
2. Legen Sie die GFs in Kunststoffboxen (Versuchseinheit).
3. Wenden Sie das Testprodukt zur Bewertung in den verschiedenen Konzentrationen an. Führen Sie die Anwendung mit einer tragbaren Sprüheinheit durch. Hier wurde eine Alkaloidemulsion bei 5% und 6% getestet.
4. Besprühen Sie als Kontrolle eine Gruppe von GFs mit Wasser.
5. Verwenden Sie mindestens drei Wiederholungen (Versuchseinheit) pro Behandlung und sprühen Sie nacheinander.
6. Lassen Sie in einer sterilen Haube zwei CBB-Erwachsene pro GFs frei (insgesamt werden 60 CBBs in die Kunststoffboxen eingeführt). Nach 30 Minuten die Kartons abdecken.
7. Lassen Sie die Kunststoffboxen mit den befallenen GFs in einem Raum oder Inkubator unter kontrollierten Bedingungen (dunkel, 25 ± 2 °C und relative Luftfeuchtigkeit 71% ± 5%).
8. Zählen Sie nach 1, 7, 15 und 21 Tagen die Anzahl der Zündfrüchte und lebenden und toten Insekten außerhalb der Früchte in jeder Box.
9. 20 Tage nach dem Befall jeden GF unter einem Stereomikroskop sezieren, 10-fache Vergrößerung.
10. Zählen Sie die Anzahl der gesunden Samen oder Samen, die von den Insekten in jeder Frucht beschädigt wurden.
11. Zählen Sie die verschiedenen CBB-biologischen Stadien²² , die beobachtet wurden, und zählen Sie die Anzahl der toten Insekten in jedem Samen, um die Insektensterblichkeit pro Versuchseinheit zu bestimmen.

5. Bewertung der Wirkung eines Produkts nach CBB-Befall (Nachbefall) (Abbildung 3)

1. Verwenden Sie Gruppen von 200 Früchten pro Behandlung.
2. In einer sterilen Haube CBB-Erwachsene (Verhältnis 2:1 von CBB-Erwachsenen zu GFs) in die zuvor desinfizierten GFs entlassen, so dass der Befall 3 h bei 21 °C anhalten kann.
3. Untersuchen Sie die GFs. Nach 3 h sollten die meisten befallen sein, wobei der Bauch der CBBs noch freigelegt sein sollte (Position A²⁰), wie in Abbildung 2 dargestellt.
4. Wählen Sie 46 befallene GFs (Position A) aus und legen Sie sie in Kunststoffgestelle mit 96 Bohrlöchern (Versuchseinheit). Die Früchte sollten in dieser Position bleiben, damit die Behandlung direkt auf die CBB gesprüht werden kann, die die Frucht perforiert.
5. Sprühen Sie mindestens dreimal (drei Racks) pro Behandlung, nacheinander, und bedecken Sie die Racks nach 30 min.
6. Lassen Sie die Racks mit den befallenen GFs in einem Raum oder Inkubator unter kontrollierten Bedingungen (dunkel, 25 ± 2 °C und relative Luftfeuchtigkeit 71% ± 5%).
7. Nach 20 Tagen sezieren Sie die GFs unter einem Stereomikroskop bei 10-facher Vergrößerung.
8. Zählen Sie die Anzahl der gesunden Samen oder Samen, die von den Insekten in jeder Frucht beschädigt wurden.
9. Zählen Sie die verschiedenen biologischen CBB-Stadien²² und die Anzahl der toten Insekten in jedem Samen, um die Insektensterblichkeit pro Versuchseinheit zu bestimmen.

6. Bewertung eines Produkts mit abschreckender Wirkung auf die CBB

1. Befolgen Sie die Schritte 4.1-4.6 zur Bewertung eines Produkts mit einer schützenden Wirkung auf die Früchte.
2. Nachdem Sie die CBB-Erwachsenen in die Plastikboxen entlassen haben, zählen Sie die Anzahl der CBBs, die von den Boxen wegfliegen, und die Anzahl, die die GFs befallen. Führen Sie dann die Schritte 4.7-4.11 aus.
3. Befolgen Sie die Schritte 5.1-5.5 zur Bewertung des Produkts nach dem CBB-Befall.
4. Nachdem Sie jede Behandlung auf die Insekten in Position A gesprüht haben, zählen Sie die Anzahl der CBBs, die sich aus der GF bewegt haben und / oder von der GF weggeflogen sind. Führen Sie dann die Schritte 5.6-5.9 aus.

7. Statistische Auswertung

HINWEIS: Die Antwortvariablen sind Mortalitätsprozentsätze im Laufe der Zeit und der Prozentsatz gesunder, unbefallener Kaffeesamen.

1. Schätzen Sie den Durchschnitt und die Standardabweichung jeder Ansprechvariablen für jede Behandlung.
2. Führen Sie eine Varianzanalyse für jede Antwortvariable mit einem Modell für ein vollständig randomisiertes Design durch.
   HINWEIS: Dunnetts 5% -Vergleichstest wird durchgeführt, um die Behandlungen mit der absoluten Kontrolle (Wasserkontrolle) zu vergleichen.
3. Wenn sich die Behandlungen signifikant von der absoluten Kontrolle unterscheiden, verwenden Sie einen LSD-Test (Least Significant Difference) von 5%, um die Behandlungen zu vergleichen.
4. Bewerten Sie die Stärke des Tests. Wenn größer als 85%, sind die Annahmen der Normalität und Homogenität der Varianzen erfüllt.

Abbildung 1: Verfahren zur Bewertung der Vorbefallwirkungen von Insektiziden auf die CBB. Schritte zur Bewertung der präinfestierenden Auswirkungen von Insektiziden auf Hypothenemus hampei (CBB) unter Verwendung von grünen Früchten (GFs). (A) Obstauswahl. (B) Sprühen der Insektizide auf die Kaffeefrüchte. (C) CBB-Befall von Kaffeefrüchten im Verhältnis 2:1 CBB je GF. (D) Befallene Früchte. (E) Inkubation der Früchte unter kontrollierten Bedingungen. (F) Fruchtsezierung. (G) Zählung der CBB-Population in den Samen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Verarbeiten Sie den CBB-Befall von Kaffeefrüchten. Die befallenen Früchte enthalten CBB-Erwachsene mit teilweise freiliegendem Bauch (Position A). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Verfahren zur Bewertung der posinfestierenden Auswirkungen von Insektiziden auf die CBB. Schritte zur Bewertung der Auswirkungen von Insektiziden nach dem Befall auf die CBB unter Verwendung von GFs. (A) Obstauswahl. (B) Befall der Früchte mit CBB im Verhältnis 2:1 CBB je GF. (C) Selektion der befallenen Früchte. (D) Aufsprühen des Insektizids auf die Früchte. (E) Inkubation der Früchte. (F) Fruchtsezierung. (G) Zählung der CBB-Bevölkerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Ergebnisse

Die Ergebnisse zeigten, dass die CBB-Weibchen die Früchte erkannten, und abhängig von den Eigenschaften der Fruchtoberfläche und den abgegebenen Gerüchen begannen die CBB-Weibchen, die Früchte innerhalb von 3 h bei 21 ° C zu durchdringen oder zu tragen.

Die Wirkung eines Insektizids auf die CBB, wenn es nach 24 h und im Laufe der Zeit auf die Kaffeefrüchte aufgetragen wird (Präbefallverfahren), ist in Abbildung 4 dargestellt. Die beiden Insektizide (Alkalo...

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Diskussion

In diesem Protokoll sind die Desinfektion der Früchte sowie der Insekten kritische Schritte. Wenn Früchte aus dem Feld im Labor verwendet werden, zeigen sie häufig eine hohe Kontamination und Austrocknung, da Mikroorganismen und Milben in der Epidermis ^7,15,16 vorhanden sind. Daher führt die Verwendung von Früchten oder Insekten, die nicht desinfiziert werden, zum Tod von Insekten aufgrund von Kontaminationen, die durch Mik...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beaker with spout, low form 500 mL	BRAND PP	BR87826
Benchtop Shaker	New Brunswick Scientific Innova 4000 Incubator Shaker
Dishwashing liquid soap-AXION	Colgate-Palmolive	AXION
Hood; Horizontal Laminar Flow Station	Terra Universal		Powder-Coated Steel, 1930 mm W x 1118 mm D x 1619 mm H, 120 V (https://www.terrauniversal.com/hood-horizontal-laminar-flow-station-9620-64a.html)
Insects CBB	BIOCAFE		(http://avispitas.blogspot.com/p/biocafe.html).
Multi Fold White paper towels	Familia	73551
Preval Spray unit	Preval Merck	Z365556-1KT	https://www.sigmaaldrich.com/CO/es/product/sigma/z365556?gclid=Cj0KCQiAweaNBhDEARIsAJ 5hwbfZOy1TWGj6huatFtRQt AzOyHe5-oBiKnOUK2T1exuuk WwJLdvxkvsaAjoYEALw_wcB
Reversible Racks 96-Well	heathrowscientific	HEA2345A	https://www.heathrowscientific.com/reversible-racks-96-well-i-hea2345a
Scalpel blades N 11	Merck	S2771-100EA
Scalpel handles N3	Merck	S2896-1EA
Sodium Hypochloride	The clorox company	Clorox
Stereo Microscope	Zeiss	Stemi 508	https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-508.html