Identifizierung von RNA-Fragmenten aus dem enzymatischen Abbau mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Zusammenfassung

MALDI-TOF wurde verwendet, um Fragmente zu charakterisieren, die aus der Reaktivität zwischen oxidierter RNA und der Exoribonuklease Xrn-1 erhalten wurden. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methodik, die auf andere Prozesse mit RNA und/oder DNA angewendet werden kann.

Zusammenfassung

RNA ist ein Biopolymer, das in allen Bereichen des Lebens vorkommt, und seine Wechselwirkungen mit anderen Molekülen und/oder reaktiven Spezies, z. B. DNA, Proteinen, Ionen, Medikamenten und freien Radikalen, sind allgegenwärtig. Infolgedessen durchläuft RNA verschiedene Reaktionen, einschließlich ihrer Spaltung, ihres Abbaus oder ihrer Modifikation, was zu biologisch relevanten Spezies mit unterschiedlichen Funktionen und Implikationen führt. Ein Beispiel ist die Oxidation von Guanin zu 7,8-Dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG), die in Gegenwart von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) auftreten kann. Insgesamt sind Verfahren, die solche Produkte und Transformationen charakterisieren, für die wissenschaftliche Gemeinschaft weitgehend wertvoll. Zu diesem Zweck ist die matrixgestützte Laserdesorptionsionisations-Time-of-Flight-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) eine weit verbreitete Methode. Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie RNA-Fragmente, die nach enzymatischer Behandlung gebildet werden, charakterisiert werden können. Das gewählte Modell verwendet eine Reaktion zwischen RNA und der Exoribonuklease Xrn-1, bei der die enzymatische Verdauung an oxidierten Stellen gestoppt wird. Zwei 20-Nukleotid lange RNA-Sequenzen [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] und [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] wurden durch Festphasensynthese erhalten, quantifiziert durch UV-Vis-Spektroskopie und charakterisiert durch MALDI-TOF. Die erhaltenen Stränge wurden dann (1) 5'-phosphoryliert und mittels MALDI-TOF charakterisiert; (2) mit Xrn-1 behandelt; (3) gefiltert und entsalzt; (4) analysiert über MALDI-TOF. Dieser Versuchsaufbau führte zur eindeutigen Identifizierung der Fragmente, die mit dem Abwürgen von Xrn-1 verbunden sind: [5'-H2 PO 4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2 PO 4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] und [5'-_{H2 PO 4}-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Die beschriebenen Experimente wurden mit 200 Picomolen RNA (20 pmol für MALDI-Analysen) durchgeführt; Geringere Mengen können jedoch zu nachweisbaren Spitzen mit Spektrometern führen, die Laserquellen mit mehr Leistung als die in dieser Arbeit verwendete verwenden. Wichtig ist, dass die beschriebene Methodik verallgemeinert und möglicherweise auf die Produktidentifizierung für andere Prozesse mit RNA und DNA ausgedehnt werden kann und bei der Charakterisierung / Aufklärung anderer biochemischer Signalwege helfen kann.

Einleitung

MALDI-TOF ^1,2,3 ist eine weit verbreitete Technik zur Charakterisierung und/oder Detektion von Molekülen unterschiedlicher Größe und Eigenschaften. Einige seiner Anwendungen umfassen verschiedene Anwendungen wie den Nachweis von Tanninen aus natürlichen Ressourcen⁴, die Bildgebung von Metaboliten in Lebensmitteln⁵, die Entdeckung oder Überwachung von zellulären Wirkstoffzielen oder Markern⁶ und die klinische Diagnostik⁷, um nur einige zu nennen. Von Relevanz für die vorliegende Arb....

Protokoll

Für die vorliegende Studie wurde RNase-freies Reinstwasser (Tabelle 1) verwendet.

1. Konzentrationsbestimmung von RNA-Lösung

1. Bereiten Sie die RNA-Probe gemäß den folgenden Schritten vor.
   1. Verwenden Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen (0,6 ml), um eine RNA-Lösung herzustellen, indem Sie 1 μL Stammlösung (erhalten durch Festphasensynthese)19 in 159 μL_{RNase-freies H2O}verdünnen. Mischen Sie die Lösung, indem Sie die Mischung wiederholt (^10x) auf und ab pipettieren.
      HINWEIS: Da eine große Auswahl an Küvetten im Handel erhältlich ist, können die benötig....

Ergebnisse

Die in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide wurden vor der Verwendung synthetisiert, charakterisiert und quantifiziert. Die Konzentration aller Oligonukleotide wurde mittels UV-Vis-Spektroskopie bei 90 °C bestimmt, um fehlerhafte Messwerte zu vermeiden, die sich aus der möglichen Bildung der Sekundärstrukturen ergeben. Abbildung 3 zeigt die Spektren der in dieser Arbeit verwendeten Modelloligonukleotide der RNA, die bei Raumtemperatur und nach Anwendung von Wärme aufgenomme.......

Diskussion

Die größte Herausforderung in diesem Arbeitsablauf bestand zwischen dem Abschluss der Experimente und der Durchführung der massenspektrometrischen Analysen. Die Experimente wurden an der University of Colorado Denver durchgeführt und abgeschlossen und (über Nacht) an die Einrichtungen der Colorado State University verschifft. Die Datenerfassung erfolgte nach Erhalt nach Bequemlichkeit. Mehrere unerwartete Umstände führten zu Zeitverzögerungen im Prozess. In einem Fall erforderten unerwartete Fehlfunktionen des In.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.6 mL MCT Graduated Violet	Fisher Scientific	05-408-127
6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98%	Sigma Aldrich	480-66-0
Acetonitrile 99.9%, HPLC grade	Fisher Scientific	75-05-8
Adenosine triphosphate, 10 mM	New Englang Bioscience	P0756S
Ammonium citrate, dibasic 98%	Sigma Aldrich	3012-65-5
Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade	Alfa Aesar	12125-01-8
Bruker bacterial test standard	Bruker Daltonics	8255343
Commercial source of Xrn-1	New England BioLabs	M0338S
Diethyl pyrocarbonate, 97%	ACROS Organics	A0368487
Flex analysis software	Bruker daltonics		FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics
Lambda 365 UV-vis spectrophotometer	Perkin Elmer
MALDI plate: MSP 96 ground steel target	Bruker Daltonics	280799
Mass Spectrometer	Bruker		Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA)
Mili-Q IQ 7000	Milipore Sigma		A Mili-Q system was used to purify all water used in this work
Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg)	Pall Corporation	OD010C33	filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size
NEBuffer 3	New England Biolabs	B7003S	This is solution B
Oligo Analyzer tool	IDT-DNA		https://www.idtdna.com/calc/analyzer
Pipette tips P10	Fisher Scientific	02-707-441
Pipette tips P200	Fisher Scientific	02-707-419
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11
T4 Polynucleotide Kinase	New England BioLabs	M0201S
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer	New England BioLabs	B0201S	This is solution A
Triflouroacetic Acid	Alfa Aesar	76-05-1
Xrn-1 exoribonuclease	Expressed in house	See ref. 20
ZipTip Pipette Tips for Sample preparation	Millipore	ZTC 18S 096	10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed