Wirkung von Hyaluronsäure 35 kDa auf ein In-vitro-Modell der vorzeitigen Dünndarmverletzung und Heilung unter Verwendung enteroid-abgeleiteter Monoschichten

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erstellung und Durchführung eines Kratzwundtests an zweidimensionalen (2D) Monoschichten, die aus dreidimensionalen (3D) Enteroiden abgeleitet sind, die aus nichtmenschlichem Primatenileum isoliert wurden.

Zusammenfassung

In-vitro-Kratzwund-Assays werden häufig verwendet, um die Mechanismen und Eigenschaften der Epithelheilung in einer Vielzahl von Gewebetypen zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung einer zweidimensionalen (2D) Monoschicht aus dreidimensionalen (3D) nichtmenschlichen Primatenenteroiden, die aus Darmkrypten des terminalen Ileums stammen. Diese enteroid-abgeleiteten Monoschichten wurden dann in einem In-vitro-Kratzwund-Assay verwendet, um die Fähigkeit von Hyaluron 35 kDa (HA35), einer menschlichen Milch-HA-Nachahmung, zu testen, Zellmigration und -proliferation entlang der epithelialen Wundkante zu fördern. Nachdem die Monolagen bis zum Konfluenzen gewachsen waren, wurden sie manuell zerkratzt und mit HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) oder Kontrolle (PBS) behandelt. Die Zellmigration und -proliferation in die Lücke wurde mit einem Durchlichtmikroskop abgebildet, das für die Bildgebung lebender Zellen ausgestattet war. Der Wundverschluss wurde mit dem Wundheilungsgrößen-Plugin in ImageJ als prozentuale Wundheilung quantifiziert. Die Kratzfläche und die Rate der Zellmigration sowie der Prozentsatz des Wundverschlusses wurden über 24 h gemessen. HA35 beschleunigt in vitro die Wundheilung in Dünndarm-Enteroid-Monoschichten, wahrscheinlich durch eine Kombination aus Zellproliferation am Wundrand und Migration in den Wundbereich. Diese Methoden können möglicherweise als Modell verwendet werden, um die Darmregeneration im Frühdarm des menschlichen Dünndarms zu untersuchen.

Einleitung

Die nekrotisierende Enterokolitis (NEC) ist einer der häufigsten gastrointestinalen Notfälle bei Frühgeborenen¹. Die Krankheit ist durch eine schwere Darmentzündung gekennzeichnet, die sich schnell zu Darmnekrose, Sepsis und möglicherweise zum Tod verschlechtern kann. Obwohl die Ätiologie unklar ist, deuten Hinweise darauf hin, dass NEC multifaktoriell ist und das Ergebnis einer komplexen Wechselwirkung von Fütterung, abnormaler bakterieller Besiedlung und einem unreifen Darmepithel^{ist 2,3}. Frühgeborene haben eine erhöhte Darmpermeabilität, eine abnormale bakterielle Besiedlung und eine....

Protokoll

Alle Tierverfahren in dieser Studie wurden vom University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Nach institutioneller Zulassung wurden fetale Dünndarmproben von einem frühgeborenen nichtmenschlichen Primaten (NHP, 90% Trächtigkeit, Olivenpavian, Papio anubis) nach Euthanasie für eine separate Studie gewonnen (Protokoll #101523-16-039-I)²⁰.

1. Etablierung von frühgeborenen nicht-menschlichen Primaten 3D Darmenteroide

1. Medienvorbereitung
   HINWEIS: Medien können bis zu 1 Woche vor der Kryptenisolierung nach aseptischer Standardtechn....

Ergebnisse

Die Auswirkungen von HA auf die Gewebereparatur und Wundheilung in verschiedenen Geweben und Organen sind gut dokumentiert; Die spezifischen Wirkungen von HA mit einem Molekulargewicht von 35 kDa auf die fetale oder neonatale Dünndarmheilung und -regeneration sind derzeit jedoch nicht bekannt. Um die Fähigkeit von HA35 zu testen, die Wundheilung in einem Modell des fetalen oder neonatalen Dünndarms zu fördern, erzeugten wir 3D-Darmenteroide aus NHP-Ileumgewebe und dissoziierten dieses Gewebe weiter in einzelne Zellen.......

Diskussion

Der Magen-Darm-Trakt eines Frühgeborenen steht unter ständigem regenerativem Druck durch wiederholte Exposition gegenüber Umwelteinflüssen im Zusammenhang mit Dysbiose, entzündlichen bakteriellen Metaboliten und Toxinen und intermittierender Hypoxie^23,24. Leider ist das Darmepithel des Frühgeborenen nicht in der Lage, schnell funktionelle Integrität herzustellen²³, was zu Barrierestörungen, erhöhter Darmpermeabilität und in schwe.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Serological Pipet	Fisher Scientific	13-675-49
100x21mm Dish, Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	172931
15 mL Conical tube	VWR	89039-666
24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate	Corning	3524
37 µM Reversible Cell Strainer	STEMCELL Technologies	27215
50 mL Conical tube	VWR	89039-658
70 µm Sterile Cell Strainers	Fisher Scientific	FB22-363-548
Albumin, Bovine (BSA)	VWR	0332-100G
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer	STEMCELL Technologies	36254
Gentle Cell Dissociation Reagent	STEMCELL Technologies	100-0485
ImageJ	NIH	imagej.nih.gov/ij/
Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument	Sartorius	4647
Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module	Sartorius	9600-0012
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	STEMCELL Technologies	06010	This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics.
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography	Millipore Sigma	L3012-10MG
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free	Corning	356231
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate	ThermoFisher Scientific	136101
PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4	Corning	21-040-CM
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	This is broad-spectrum antibiotics
Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K	Lifecore Biomedical	HA20K-1
TC20 Automated Cell Counter	Company: Bio-Rad	1450102
Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin	Fisher Scientific	MT25053CI
Y-27632	STEMCELL Technologies	72302