Der Caco-2-Zell-Bioassay zur Messung der Eisenbioverfügbarkeit von Lebensmitteln

Zusammenfassung

Der Caco-2-Zell-Bioassay für die Bioverfügbarkeit von Eisen (Fe) stellt einen kostengünstigen und vielseitigen Ansatz zur Beurteilung der Fe-Bioverfügbarkeit von Lebensmitteln, Lebensmittelprodukten, Nahrungsergänzungsmitteln, Mahlzeiten und sogar Diäten dar. Es wurde gründlich für Humanstudien validiert und stellt den Stand der Technik für Studien zur Fe-Bioverfügbarkeit dar.

Zusammenfassung

Das Wissen über die Bioverfügbarkeit von Fe ist entscheidend für die Beurteilung der Ernährungsqualität von Fe in Lebensmitteln. Die In-vivo-Messung der Fe-Bioverfügbarkeit ist durch Kosten, Durchsatz und die Vorbehalte begrenzt, die der Isotopenmarkierung des Lebensmittels Fe innewohnen. Daher besteht ein kritischer Bedarf an einem Ansatz, der mit hohem Durchsatz und kostengünstig ist. Der Caco-2-Zellbioassay wurde entwickelt, um diesen Bedarf zu decken. Der Caco-2-Zell-Bioassay für die Fe-Bioverfügbarkeit verwendet eine simulierte Magen- und Darmverdauung in Verbindung mit der Kultur einer menschlichen Darmepithelzelllinie, die als Caco-2 bekannt ist. In Caco-2-Zellen stimuliert die Fe-Aufnahme die intrazelluläre Bildung von Ferritin, einem Fe-Speicherprotein, das leicht mit einem Enzym-gebundenen Immunassay (ELISA) gemessen werden kann. Ferritin bildet sich proportional zur Fe-Aufnahme; So kann man durch die Messung der Caco-2-Zellferritinproduktion die intestinale Fe-Aufnahme aus simulierten Nahrungsverdauungen in die Enterozyten beurteilen.

Über diesen Ansatz repliziert das Modell den wichtigsten ersten Schritt, der die Bioverfügbarkeit von Lebensmittel-Fe bestimmt. Seit seiner Einführung im Jahr 1998 wurde dieser Modellansatz rigoros mit Faktoren verglichen, von denen bekannt ist, dass sie die menschliche Fe-Bioverfügbarkeit beeinflussen. Darüber hinaus wurde es in parallelen Studien angewendet, wobei drei Wirksamkeitsstudien am Menschen biofortifizierte Fe-Pflanzen bewerteten. In allen Fällen sagte der Bioassay die relativen Mengen an Fe-Bioverfügbarkeit aus den Faktoren, den Kulturen und der Gesamternährung korrekt voraus. Dieser Artikel enthält detaillierte Methoden zur Caco-2-Zellkultur in Verbindung mit dem In-vitro-Verdauungsprozess und dem Zellferritin-ELISA, der für die Durchführung des Caco-2-Zell-Bioassays für die Fe-Bioverfügbarkeit erforderlich ist.

Einleitung

Um den Forschungsbedarf und Nutzen des Caco-2-Zell-Bioassays für die Fe-Bioverfügbarkeit vollständig zu verstehen, müssen zunächst die Ansätze verstanden werden, die vor dem Aufkommen dieses Modells vorhanden waren. Die Messung der Fe-Bioverfügbarkeit aus einem Lebensmittel oder einer Mahlzeit in vivo ist eine anspruchsvolle Aufgabe, insbesondere wenn Kombinationen von Lebensmitteln in einer Mahlzeit oder Diät bewertet werden müssen. Die Isotopenmarkierung war in den letzten 50 Jahren der gebräuchlichste Ansatz zur Messung der Fe-Bioverfügbarkeit¹. Die Isotopenmarkierung wird für Einzelmahlzeiten- und Mehrmahlzeitenstudien verwendet un....

Protokoll

HINWEIS: Als praktischer Anhaltspunkt für die Leser beschreibt die folgende Methodik die spezifischen Kulturbedingungen und Materialien, die für die Messung der Fe-Bioverfügbarkeit von 20 experimentellen Proben erforderlich sind, sowie die erforderlichen Qualitätskontrollen in einem Durchlauf des Bioassays. Eine Erhöhung der Anzahl der Proben über diese Kapazität hinaus wird aufgrund der Zeit, die für verschiedene Zellkultur- und In-vitro-Verdauungsschritte innerhalb des Bioassays benötigt wird, nicht empfohlen.

1. Auswahl der Probenmenge

1. Bestimmen Sie bei festen oder flüssigen Lebensmitteln eine Menge an....

Ergebnisse

Identifizierung und Messung der Fe-Bioverfügbarkeit in Grundnahrungsmitteln
Einer der Hauptgründe für die Entwicklung dieses Modells war die Identifizierung von Faktoren, die die Bioverfügbarkeit von Fe in Grundnahrungsmitteln beeinflussen, und die Bereitstellung eines Werkzeugs für Pflanzenzüchter, das es ihnen ermöglichen würde, Sorten mit verbesserter Fe-Bioverfügbarkeit zu identifizieren und zu entwickeln. Die gemeine Bohne (Phaseolus vulgaris) wurde weltweit als Nutzpflanze für.......

Diskussion

Seit seiner Einführung wurden zahlreiche Studien veröffentlicht, die diese Methode für den Caco-2-Zell-Bioassay beschreiben. Die Rahmenbedingungen sind seit der Erstveröffentlichung 1998 relativ unverändert geblieben¹⁸. In den letzten 20 Jahren wurden jedoch zahlreiche technische Details verfeinert und standardisiert, um eine beispiellose Konsistenz in der Reaktion des Bioassays zu erzielen. Die sorgfältige und präzise Einhaltung der Zellkultur und der In-vitro-Verdauungsbedingungen

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M HCl	Fisher Scientific	A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade
18 megaohm water			Also known as distilled, deionized water
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt	Sigma Aldrich Co	T6397
6-well plates	Costar	3506	Use for bioassay experiments
ascorbic acid	Sigma Aldrich Co	A0278
bile extract	Sigma Aldrich Co	B8631
Caco-2 cells	American Type Culture Collection	HTB-37	HTB-37 is a common variety.
Cell culture flasks T225	Falcon	353138
Cell culture flasks T25	Corning	430639
Cell culture flasks T75	Corning	430641U
Chelex-100	Bio-Rad Laboratories Inc	142832	Known as the weak cation exchange resin in the protocol
collagen	Corning	354236
dialysis membrane	Spectrum Laboratories	Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO	Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Gibco	12100046	DMEM
epidermal growth factor	Sigma Aldrich Co	E4127-5X.1MG
Ferritin ELISA Assay Kit	Eagle Biosciences	FRR31-K01
fetal bovine serum	R&D Systems	S12450	Optima
HEPES	Sigma Aldrich Co	H3375
Hydrocortisone-Water Soluble	Sigma Aldrich Co	H0396
insert ring	Corning Costar	not sold	Transwell, for 6 well plate, without membrane
insulin	Sigma Aldrich Co	I2643
KCl	Sigma Aldrich Co	P9333
large column	VWR International	KT420400-1530
Minimum Essential Medium	Gibco	41500034	MEM
NaCl	Fisher Scientific	S271
pancreatin	Sigma Aldrich Co	P1750
PIPES disodium salt	Sigma Aldrich Co	Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768
porcine pepsin	Sigma Aldrich Co	P6887 or (P7012-25G Sigma
protein assay kit	Bio-Rad Laboratories Inc	Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116	Measurement of Caco-2 cell protein
silicone o rings	Web Seal, Inc Rochester NY	2-215S500
sodium bicarbonate	Fisher Scientific	S233
Sodium selenite	Sigma Aldrich Co	S5261
ZellShield	Minerva Biolabs	13-0050	Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific