Millisekunden-Wasserstoff/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Untersuchung der Alpha-Synuclein-Strukturdynamik unter physiologischen Bedingungen

Zusammenfassung

Das strukturelle Ensemble des monomeren Alpha-Synucleins beeinflusst seine physiologische Funktion und seine physikalisch-chemischen Eigenschaften. Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie eine Millisekunden-Wasserstoff/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie und anschließende Datenanalysen durchgeführt werden können, um Konformationsinformationen über das Monomer dieses intrinsisch ungeordneten Proteins unter physiologischen Bedingungen zu bestimmen.

Zusammenfassung

Alpha-Synuclein (aSyn) ist ein intrinsisch ungeordnetes Protein, dessen fibrilläre Aggregate in Lewy-Körpern und Neuriten, den Kennzeichen der Parkinson-Krankheit, reichlich vorhanden sind. Ein Großteil seiner biologischen Aktivität sowie seine Aggregation betreffen jedoch zentral die lösliche Monomerform des Proteins. Die Aufklärung der molekularen Mechanismen der aSyn-Biologie und Pathophysiologie erfordert strukturell hochaufgelöste Methoden und ist empfindlich gegenüber biologischen Bedingungen. Seine nativ entfalteten, metastabilen Strukturen machen monomere aSyn für viele strukturbiologische Techniken unlösbar. Hier wird die Anwendung eines solchen Ansatzes beschrieben: Wasserstoff/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (HDX-MS) auf der Millisekunden-Zeitskala zur Untersuchung von Proteinen mit geringer thermodynamischer Stabilität und schwachen Schutzfaktoren, wie z.B. aSyn. Auf der Millisekunden-Zeitskala enthalten HDX-MS-Daten Informationen über die Zugänglichkeit von Lösungsmitteln und die wasserstoffgebundene Struktur von aSyn, die bei längeren Markierungszeiten verloren gehen, was letztendlich zu einer strukturellen Auflösung bis zum Aminosäureniveau führt. Daher kann HDX-MS bei hohen strukturellen und zeitlichen Auflösungen Informationen über Konformationsdynamik und Thermodynamik, intra- und intermolekulare Wechselwirkungen und die strukturellen Auswirkungen von Mutationen oder Veränderungen der Umweltbedingungen liefern. Obwohl breit anwendbar, wird gezeigt, wie Millisekunden-HDX-MS-Messungen in monomeren aSyn erfasst, analysiert und interpretiert werden können.

Einleitung

Die Parkinson-Krankheit (PD) ist eine neurodegenerative Erkrankung, von der weltweit Millionen von Menschen betroffen^{sind 1}. Es ist gekennzeichnet durch die Bildung von zytoplasmatischen Einschlüssen, die als Lewy-Körper und Lewy-Neuriten in der Substantia nigra pars compacta-Region des Gehirns bekannt sind. Es wurde festgestellt, dass diese zytoplasmatischen Einschlüsse Aggregate des intrinsisch ungeordneten Proteins aSyn² enthalten. Bei PD und anderen Synucleinopathien wandelt sich aSyn von einem löslichen ungeordneten Zustand in einen unlöslichen, hochstrukturierten Krankheitszustand um. In seiner nativen Form nimmt d....

Protokoll

1. Proteinexpression und Reinigung von aSyn

1. Bereiten Sie aSyn nach einem zuvor veröffentlichten Bericht^{vor 9}.
2. Dialysieren Sie in einen sicheren Speicherpuffer (z. B. Tris, pH 7,2 ).
3. Konzentrieren Sie bei Bedarf die Probe (z. B. Spinfilter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 3 kDa MWCO, 14.000 x g für ca. 10-30 min, siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Es wird empfohlen, sich nicht übermäßig zu konzentrieren. Die Integrität des Monomer-Ensembles wurde nicht über 25 μM hinaus verifiziert.
4. Aliquot und bei −80 °C lagern
   HINWEIS: Das aSyn-Monomerprotein ist unter diesen La....

Ergebnisse

Aufgrund seiner intrinsisch ungeordneten Natur ist es schwierig, die komplizierten strukturellen Veränderungen in aSyn bei physiologischem pH-Wert zu erfassen. HDX-MS überwacht den Isotopenaustausch an Backbone-Amid-Wasserstoffen und untersucht die Proteinkonformationsdynamik und -wechselwirkungen. Es ist eine der wenigen Techniken, diese Informationen mit hohen strukturellen und zeitlichen Auflösungen zu erfassen. Dieses Protokoll ist allgemein auf eine breite Palette von Proteinen und Pufferbedingungen anwendbar, un.......

Diskussion

Im vorliegenden Artikel werden die folgenden Verfahren beschrieben: (1) Durchführung von Peptid-Mapping-Experimenten an monomerem aSyn, um die höchste Sequenzabdeckung zu erhalten, (2) Erfassung von Millisekunden-HDX-MS-Daten auf monomerem aSyn unter physiologischen Bedingungen und (3) Durchführung von Datenanalysen und -interpretationen der resultierenden HDX-MS-Daten. Die bereitgestellten Verfahren sind im Allgemeinen einfach auszuführen, jedes Kennzeichnungsexperiment dauert in der Regel nur etwa 8 Stunden für dr.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column	Waters Corporation	186002346	Analytical column
Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolv	VWR	20060.420	For LC mobile phases
CaCl2	Sigma Aldrich	C5670	Salt for HDX buffers
Chronos	Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation)	667006090	Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell
Deuterium chloride	Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)	DLM-2-50	For HDX labelling buffers
Deuterium oxide (99.9% D2O)	Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)	DLM-4	Deuterated water
DynamX 3.0	Waters Corporation	176016027	Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation
Enzymate BEH Pepsin Column	Waters Corporation	186007233	Pepsin digestion column
Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade	Fisher Scientific	10596814	For LC mobile phases
Guanidinium hydrochloride	Sigma Aldrich	RDD001-500G	Chaotrope/Denaturant
HDfleX	University of Exeter	N/A	https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982
KCl	Sigma Aldrich	P3911	Salt for HDX buffers
LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot	Waters Corporation	725000637	Autosampler robot
Leucine enkephalin	Waters Corporation	186006013	For mass spectrometry lockspray calibration.
MassLynx	Waters Corporation	667004007	Software controlling inlet methods and mass spectrometer
Maximum recovery vials	Waters Corporation	600000670CV	100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266	Salt for HDX buffers
Millipore 0.22 µm syringe filters	Millipore	N9CA7069B	Syringe filters
ms2min	Applied Photophysics Ltd	N/A	fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument
NaCl	Sigma Aldrich	S9888	Salt for HDX buffers
Peltier temperature controller	LEAP Technologies Inc.	HP115-COOL/D	Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.
ProteinLynx Global Server 3.0	Waters Corporation	715001030	Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.
Reagent pot caps	Waters Corporation	186004632	100 pack
Reagent pots for LEAP HDX-2	Waters Corporation	186001420	100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2
Sodium deuteroxide (99.5% in D2O)	Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)	DLM-57	For HDX labelling buffers
Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO)	Amicon (Merck Sigma Aldrich)	UFC5003	Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.
Synapt G2-Si mass spectrometer	Waters Corporation	176850035	Mass spectrometer
Total recovery vials	Waters Corporation	600000671CV	100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253-250G	Buffer
Trizma base	Sigma Aldrich	T60040-B2005	Buffer
Urea	Sigma Aldrich	U5378-1KG	Chaotrope/Denaturant
VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column	Waters Corporation	186004623	Trap desalting column