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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Diese Studie stellt ein neues Protokoll vor, um mechanische Kraft direkt auf den Zellkern durch magnetische Mikroperlen auszuüben, die in das Zytoplasma abgegeben werden, und simultane Live-Zell-Fluoreszenzbildgebung durchzuführen.

Zusammenfassung

Eine grundlegende Frage in der Mechanobiologie ist, wie lebende Zellen extrazelluläre mechanische Reize im Kontext der Zellphysiologie und -pathologie wahrnehmen. Es wird angenommen, dass die zelluläre Mechano-Empfindung extrazellulärer mechanischer Reize durch die Membranrezeptoren, den zugehörigen Proteinkomplex und das Zytoskelett erfolgt. Jüngste Fortschritte in der Mechanobiologie zeigen, dass der Zellkern im Zytoplasma selbst selbstständig mechanische Reize gleichzeitig wahrnehmen kann. Ein mechanistisches Verständnis darüber, wie der Zellkern mechanische Reize wahrnimmt, umleitet und darauf reagiert, fehlt jedoch, hauptsächlich aufgrund der technischen Herausforderungen beim Zugriff auf und der Quantifizierung der Kernmechanik mit herkömmlichen Werkzeugen. Dieses Papier beschreibt das Design, die Herstellung und die Implementierung eines neuen magnetischen Kraftaktors, der präzise und nicht-invasive mechanische 3D-Reize anwendet, um den Zellkern direkt zu verformen. Unter Verwendung von CRISPR/Cas9-Zellen zeigt diese Studie, dass dieses Werkzeug in Kombination mit hochauflösender konfokaler fluoreszierender Bildgebung die Aufdeckung der Echtzeitdynamik eines mechanosensitiven yes-assoziierten Proteins (YAP) in einzelnen Zellen als Funktion der Kernverformung ermöglicht. Diese einfache Methode hat das Potenzial, die derzeitige Technologielücke in der Mechanobiologie zu schließen und Antworten auf die Wissenslücke zu geben, die in der Beziehung zwischen Kernmechanotransduktion und Zellfunktion besteht.

Einleitung

Diese Studie zielt darauf ab, eine neue Technik zur Aufklärung der Kernmechanobiologie zu entwickeln und anzuwenden, indem die magnetischen Aktoren, die mechanische Kraft direkt auf den Zellkern ausüben, und die konfokale Fluoreszenzmikroskopie, die gleichzeitig die strukturellen und funktionellen subzellulären Veränderungen abbildet, kombiniert werden. Zellen erfassen extrazelluläre biophysikalische Signale einschließlich Gewebesteifigkeit 1,2,3,4, interstitiellen Flüssigkeitsdruck und Scherspannung 5,6,7, Oberflächentopologie/-geometrie 8,9,10,11,12 und Zug-/Druckspannung13,14, 15,16. Biophysikalische Signale werden in biochemische Signale umgewandelt und lösen mögliche nachgeschaltete Veränderungen der Genexpression und des Zellverhaltens aus - ein Prozess, der als Mechanotransduktion bekannt ist 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Um Mechanotransduktionsprozesse zu untersuchen, wurde eine Vielzahl von Techniken entwickelt, um mechanische Kraft auf die Zellen auszuüben, wie Rasterkraftmikroskopie28, Zelldehnungsgerät29, Bio-MEMS (mikroelektromechanische Systeme) Kraftsensor 15,30,31, Scherrheologie 32 und Stereo Vision System 33 . Eine kürzlich durchgeführte Übersicht fasst die Ansätze zur Anwendung extrazellulärer mechanischer Hinweise und zur Störung der Mechanosensorik zusammen34. Bisher üben die meisten dieser Methoden Kraft auf die Zellplasmamembran aus, und Zellen empfangen diese extrazellulären biophysikalischen Signale direkt über Membranrezeptoren wie Integrin, Cadherin, Ionenkanäle und G-Protein-gekoppelte Rezeptoren. Anschließend leiten sie das Signal an das intrazelluläre Zytoskelett und den Zellkern weiter. Zum Beispiel wird gezeigt, dass Zellen unter Verwendung der YAP-Translokation (Yes-assoziiertes Protein) als Indikator für die Mechano-Sensorik die mechanischen Signale der Substratsteifigkeit und extrazellulären Spannung von der Zellmembran wahrnehmen und durch das Zytoskelett in den Zellkern übertragen, um eine YAP-Zytoplasma-zu-Zellkern-Translokation zu induzieren28,35.

Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass der Zellkern selbst ein unabhängiger Mechanosensorist 8,36,37. Dies wird durch Experimente bewiesen, die an dem isolierten Kern aus Zellen durchgeführt wurden, wo gezeigt wurde, dass Kerne ihre Steifigkeit adaptiv als Reaktion auf die mechanische Kraft ändern, die direkt auf sie ausgeübt wird36. Unter vielen physiologischen Bedingungen nehmen Kerne sowohl in Tumor- als auch in gesunden Zellen extrazelluläre biophysikalische Signale wahr und verändern ihre mechanischen Eigenschaften und Anordnungen38,39,40. Zum Beispiel nimmt bei Extravasation die Kernsteifigkeit von Tumorzellen ab und hält die Weichheit für mehr als 24 h38 aufrecht. Während der Migration durch den begrenzten interstitiellen Raum verlieren die Kerne von Tumorzellen häufig ihre strukturelle Integrität und gewinnen sie wieder39. Die Art und Weise, wie der Zellkern das biophysikalische Signal wahrnimmt, ist jedoch unbekannt, obwohl mehrere Kernhüllproteine und Proteinfamilien beteiligt sind, wie Lamin A / C und Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC) -Komplex38,41. Neue nicht-invasive Methoden, die direkt Kraft auf den Zellkern ausüben können, werden daher die Wirkung der Kraftübertragung von der Zell-Plasma-Membran und dem Zytoskelett entkoppeln und dazu beitragen, die bisher unzugänglichen molekularen Mechanismen der nuklearen Mechano-Sensorik aufzuklären.

Forschungen, die optische Pinzetten zur Manipulation von Organellen42 und Mikroperlen, die in Zellen43 injiziert wurden, verwendeten, zeigten die technologische Fähigkeit, direkt Kraft auf den Kern auszuüben. Die optische Pinzettentechnik hat jedoch mehrere Einschränkungen: (1) optische Pinzetten mit niedrigem Durchsatz manipulieren oft nur eine Zelle oder Mikroperle gleichzeitig; und (2) potentielle Photoschäden und Temperaturartefakt-Verformungen von Kernkern erfordern Dutzende von pN36, und die entsprechende notwendige Laserleistung beträgt etwa 10 mW pro pN44,45. Eine solche Laserintensität ist ausreichend, um Photoschäden in den Zellen auszulösen und die Zellfunktionen während des Experiments46 zu stören.

Die magnetische Kraft, die durch Mikroperlen in lebenden Zellen ausgeübt wird, zeigt das Potenzial, direkt Kraft auf den Kern auszuüben und überwindet die Einschränkungen optischer Pinzetten. Sobald Mikroperlen in das Zytoplasma abgegeben werden, kann ein Magnetfeld eine magnetische Kraft auf mehrere Mikrokügelchen gleichzeitig und mit hohem Durchsatz ausüben. Das Magnetfeld beeinflusst nicht die Zellfunktionen47, sondern erzeugt Kraft von pN nach nN, was ausreicht, um eine Kernverformung 36,48,49 zu induzieren. Bisher wurde die Manipulation magnetischer Mikroperlen an der Zellplasmamembran48, im Zytoplasma50, an F-Aktin51, im Kern47 und am isolierten Kern36 angewendet. Die magnetische Manipulation von Mikroperlen wurde jedoch nie verwendet, um direkte mechanische Kraft auf die Kernhülle auszuüben, um die Mechanotransduktion im Kern zu untersuchen.

In dieser Arbeit wird eine einfache Technik entwickelt, um nicht-invasiv magnetische Mikroperlen in das Zytoplasma zu transportieren und diese Mikroperlen zu verwenden, um mechanische Kraft auf den Kern auszuüben (Abbildung 1). Hier werden CRISPR/Cas9-entwickelte humane normale B2B-Zelllinien, die endogen mNeonGreen21-10/11-markiertes YAP exprimieren, verwendet, um die Methode zu validieren. YAP ist ein mechanosensitives Protein, und die Translokation von YAP wird durch nukleare mechano-sensingreguliert 14,28. Der CRISPR/Cas9-regulierte Knock-in-Ansatz wurde gewählt, um endogenes YAP mit einem fluoreszierenden Protein (FP) mNeonGreen21-10/11 zu markieren. Obwohl bekannt ist, dass die CRISPR-Bearbeitung eine unvollständige Effizienz und einen Off-Target-Effekt hat, integrierten die Protokolle in früheren Publikationen eine Fluoreszenzsortierung, um die korrekte Einfügung des offenen Leserahmens52,53,54 auszuwählen. Mit dieser zusätzlichen Selektionsschicht wurde in 20+ Zelllinien, die zuvor52,53,54,55 erzeugt wurden, kein Off-Target-Tagging-Ereignis beobachtet. Dies ist ein Split-Fluoreszenzprotein-Konstrukt, aber im Prinzip könnte jede ausdrückbare fluoreszierende Markierung verwendbar sein. Dieser Markierungsansatz ist Transgen- oder Antikörpermethoden überlegen. Erstens behält das markierte Protein im Gegensatz zur Transgenexpression die Einzelkopie-Gendosierung bei und exprimiert im physiologischen Kontext des nativen genregulatorischen Netzwerks, wodurch Abweichungen in Proteinkonzentration, Lokalisation und Interaktion begrenzt werden. Die in dieser Studie verwendete Tagging-Methode erreicht über eine Größenordnung einen höheren Durchsatz und eine höhere Effizienz als das vollständige FP-Tagging. Es vermeidet auch Herausforderungen im Zusammenhang mit Immunfluoreszenz aufgrund von Fixierungsartefakten und der begrenzten Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen Antikörpern mit hoher Spezifität. Zweitens führt der in dieser Arbeit verwendete Ansatz eine minimale Störung der Zellphysiologie durch und ermöglicht die authentische Offenbarung aller endogenen YAPs in Echtzeit. Im Gegensatz dazu führen andere gängige Transgenmethoden oft zu einer Überexpression von YAP. Die daraus resultierende künstliche Verteilung kann möglicherweise Zytotoxizität verursachen und die mechano-sensing von Zellenbeeinflussen 56,57,58.

Diese Studie stellt ein Protokoll vor, um durch magnetische Mikroperlen, die in das Zytoplasma abgegeben werden, direkt Kraft auf den Kern auszuüben und gleichzeitig eine Live-Zell-Fluoreszenzbildgebung durchzuführen. Zusammenfassend zeigen die hier vorgestellten Protokolle, wie man (1) magnetische Mikroperlen in die Zelle außerhalb des Kerns liefert, (2) die Mikroperlen manipuliert, um magnetische Kraft auf den Kern auszuüben, (3) konfokale fluoreszierende Bildgebung der Zellen während der Manipulation durchführt und (4) das YAP-Kern- / Zytoplasma-Verhältnis (N / C) während des gesamten Kraftanwendungsprozesses quantitativ analysiert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass (1) durch Endozytose magnetische Mikrokügelchen innerhalb von 7 h nicht-invasiv in das Zytoplasma von B2B-Zellen abgegeben werden können (Abbildung 2 und Abbildung 3); und (2) quantifizierte magnetische Kraft, die direkt auf den Kern ausgeübt wird (Abbildung 4, Abbildung 5 und Abbildung 6), kann allein verschiedene Änderungen des YAP N / C-Verhältnisses in CRISPR / Cas9-B-Zellen auslösen (Abbildung 7 und Abbildung 8).

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Protokoll

1. Wartung von CRISPR/Cas9-entwickelten B2B-Zellen

  1. Kultur von B2B-Zellen in einem T25-Kolben mit RPMI-1640, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin.
  2. Die B2B-Zellen werden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2 gehalten.
  3. Subkultur der B2B-Zellen, wenn der Konfluenz 70% bis 80% erreicht.
  4. Lagern Sie die B2B-Zelllinie in RPMI-1640 Kulturmedium mit 10% (v/v) DMSO in einem -80 °C Gefrierschrank.
  5. Verwenden Sie die B2B-Zellen mit einer Passagenzahl kleiner als 10 in den Experimenten.

2. Zellkultur

  1. Säen Sie die Zellen auf eine Petrischale mit Glasboden.
    1. Bringen Sie den Kolben, der B2B-Zellen enthält, vom Inkubator in die Biosicherheitswerkbank.
    2. Entfernen Sie das Kulturmedium im Kolben mit einer Ansaugpipette mit angeschlossener Vakuumpumpe.
    3. Waschen Sie den Kolben mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
    4. Entfernen Sie PBS mit der Ansaugpipette.
    5. Fügen Sie 0,5 ml 0,05% ige Trypsinlösung hinzu, um die Zellen vom Boden des Kolbensubstrats zu lösen.
    6. Stellen Sie den Kolben für 5 min in den Inkubator.
    7. Bringen Sie den Kolben in die Biosicherheitswerkbank. 5 ml neues Kulturmedium in den Kolben geben und die Lösung nach oben und unten pipettieren.
    8. 50 μL des Mediums mit Zellen (300 Zellen/μL) auf die Glasboden-Petrischale geben. 2 ml Kulturmedium in die Petrischale geben.
    9. Stellen Sie die Petrischale in den Inkubator. Warten Sie 12 Stunden, bis die Zellen angebracht sind.
  2. Kulturieren Sie die Zellen mit magnetischen Mikroperlen.
    1. Er wiegt 0,2 g Carbonyleisen-Mikroperlen mit einem mittleren Durchmesser von 7 μm (im Folgenden 7 μm Mikroperlen genannt, siehe Materialtabelle).
    2. Verwenden Sie eine Pipette, um die Mikroperlen in 1 ml RPMI-1640-Kulturmedium aufzuhängen.
    3. Bringen Sie die Petrischale mit B2B-Zellen zur Biosicherheitswerkbank.
    4. 200 μL des mikroperlenhaltigen Mediums in die Petrischale geben.
      HINWEIS: Fügen Sie das Medium schnell hinzu, um den Niederschlag der Mikroperlen zu vermeiden.
    5. Stellen Sie die Petrischale zurück in den Inkubator, bis Mikroperlen von den Zellen verinnerlicht sind. Überprüfen Sie die Internalisierung alle 6 h, um den optimalen Zeitpunkt für die Internalisierung für verschiedene Zelllinien zu bestimmen.
    6. Um die Internalisierung zu überprüfen, führen Sie konfokale Fluoreszenzbildgebung durch, um die Mikroperlen-, Kern- und Zellgrenze zu visualisieren. Wenn die Mikroperle von der Zelle verinnerlicht wird, befindet sie sich innerhalb der Zellgrenze.

3. Visualisierung des Zellkerns

  1. 1,5 mL des Kulturmediums im Inkubator für 15 min erwärmen.
  2. Schalten Sie das Licht der Biosicherheitswerkbank aus. Nehmen Sie die Petrischale, die die Zelle, das erwärmte Kulturmedium, die Kernfärbung und Verapamil HCl enthält, in die Biosicherheitswerkbank.
    HINWEIS: Kernfärbungskomponenten sind lichtempfindlich. Vermeiden Sie Lichteinwirkung während des Betriebs.
  3. Verdünnen Sie den 1000-fachen Kernfleck mit DMSO auf 100x.
  4. 100 mM Verapamil HCl durch DMSO auf 10 mM verdünnen.
  5. 15 μL 100x Kernfärbung und 15 μL 10 mM Verapamil HCl zu 1,5 ml Kulturmedium geben. Gut mischen, indem Sie auf und ab pipettieren.
  6. Entfernen Sie das Kulturmedium aus der Petrischale. Geben Sie das Kulturmedium mit der Kernfärbung in die Petrischale.
  7. Legen Sie die Zellen für mehr als 2 h zurück in den Inkubator.

4. Vorbereitung der Magnetkraft-Anwendungshardware

  1. 3D-Druck aller Teile mit Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS) und Montage nach dem CAD-Design (Abbildung 1A). Die CAD-Konstruktion ist in der Materialtabelle enthalten.
  2. Verwenden Sie doppelseitiges Klebeband, um den Magneten an der Magnetbewegungsvorrichtung zu befestigen (Abbildung 1A).
  3. Stellen Sie das magnetbewegliche Gerät neben den Mikroskoptisch. Verwenden Sie die drei Knöpfe, um die räumliche Position des Magneten einzustellen, bis er sich zwischen 13 mm und 120 mm über die Petrischale bewegen kann.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die obere Grenze des Abstands zwischen Magnet und Petrischale so groß wie möglich ist, um unerwünschte Krafteinwirkung auf die magnetischen Mikroperlen zu vermeiden. 120 mm ist der Maximalwert in diesem Versuchsaufbau. Stellen Sie sicher, dass der Magnet die Mikroskopteile, einschließlich Objektive und motorisierte Tische, nicht stört.
  4. Stellen Sie den Magneten auf die höchste Z-Position (bei 120 mm).

5. Kraftanwendung und Lebendzellbildgebung

  1. Aufbau der Umgebungskammer für Langzeitbildgebung
    1. Tragen Sie 75% ige Ethanollösung auf, um die Umgebungskammer gründlich zu sterilisieren und zu reinigen.
    2. Stellen Sie die Umgebungskammer auf den motorisierten Tisch des inversen Mikroskops.
    3. Öffnen Sie den CO 2 -Tank und stellen Sie den CO2 -Zufluss auf 160 ml/min ein.
    4. Stellen Sie die Temperatur der Kammer auf 44 °C (oben), 42 °C (Bad) und 40 °C (Tisch) ein.
    5. Geben Sie 20 ml gereinigtes Wasser in das Bad der Umgebungskammer, um 90% Luftfeuchtigkeit zu erhalten.
    6. Nehmen Sie die Petrischale mit Glasboden, die Zielzellen enthält, aus dem Gewebekulturinkubator heraus und legen Sie sie in die Kammer.
    7. Bringen Sie die Metallklemme der Umgebungskammer an, um die Position der Petrischale zu fixieren.
      HINWEIS: Die Petrischale muss fest in der Kammer eingespannt werden, da die Magnetkraft die Schale bewegen kann, wenn sie nicht eingespannt ist.
    8. Schließen Sie den Deckel der Kammer.
  2. Optimierung von Bildgebungsparametern
    1. Optimieren Sie die Pinhole-Größe: Das Pinhole blockiert die unscharfen Photonen. Eine größere Pinhole-Größe liefert mehr unscharfe Photonen, aber ein helleres Bild. Eine kleinere Lochblendengröße ergibt ein fokussierteres und dunkleres Bild. Stellen Sie sicher, dass Sie die Lochgröße optimieren, um konfokale Bilder mit dem entsprechenden Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten.
    2. Laserintensität optimieren: Die Laserintensität bestimmt die Intensität der Anregung und damit das Emissionslicht. Die geringe Laserintensität sorgt für ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis. Eine zu hohe Laserintensität führt zu Photobleiche. Stellen Sie die Laserintensität entsprechend ein.
    3. Optimieren Sie die Schrittweite und Schritte: Schritte und Schrittweite bestimmen, wie viele Bilder in einem Z-Stack aufgenommen werden. Kleinere Schrittgrößen und mehr Schritte erhöhen die Auflösung des Z-Stacks, erhöhen aber auch das Photobleaching. In diesem Experiment wurde 1 μm Schrittweite für die Zellen mit ~15 μm Zellhöhe verwendet.
    4. Belichtungszeit optimieren: Die Belichtungszeit bestimmt, wie lange die Zelle dem Anregungslaser ausgesetzt wird. Eine geringe Belichtungszeit verringert das Signal-Rausch-Verhältnis. Eine hohe Belichtungszeit führt zu Photobleiche. In diesem Experiment wurde eine Belichtungszeit von 1 Bild pro 4 s verwendet.
    5. Optimierung der Bildgebungsparameter: Ändern Sie einen der vier Parameter iterativ und halten Sie die anderen Parameter konsistent. Messen Sie jedes Mal das YAP N/C-Verhältnis jedes Bildes und vergleichen Sie die Änderung des YAP N/C-Verhältnisses, um den Photobleichpegel zu bestimmen. Wiederholen Sie den Optimierungsprozess, bis ein Gleichgewicht zwischen Signal-Rausch-Verhältnis, Bildgeschwindigkeit und Fotobleiche erreicht ist.
    6. Definieren Sie die Imaging-Konfigurationen mit den optimierten Imaging-Parametern für schnellere Imaging-Einstellungen während der Experimente.
      HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten Konfigurationen sind in Abschnitt 5.3 der Bildgebungsparameter beschrieben. Um die Imaging-Parameter der Konfigurationen in Abschnitt 5.3 zu optimieren, verwenden Sie dieselbe Methode wie in Schritt 5.2.5.
  3. Kleine Kraftanwendung und konfokale Bildgebung
    HINWEIS: Nikon Ti2-E Mikroskop wurde für die Bildgebung in dieser Studie verwendet, und detaillierte Schritte für die Bildaufnahme sind unten angegeben.
    1. Öffnen Sie das invertierte Mikroskop. Öffnen Sie die Softwareanwendung Elements.
    2. Definieren Sie Konfigurations magnetic_find. Überprüfen Sie nur den FITC-Kanal. Stellen Sie PMT HV = 70, Offset = 0, Laserintensität = 10 ein. Stellen Sie die Scangeschwindigkeit auf 1 Bild pro 2 s ein, indem Sie auf die 1/2-Schaltfläche klicken. Stellen Sie die Lochgröße auf 1,2 AE ein, indem Sie auf die Schaltfläche 1,2 AU klicken. Diese Konfiguration wird in Schritt 5.3.5 verwendet.
    3. Definieren Sie die Konfiguration magnetic_YAP_Nucleus. Überprüfen Sie den FITC-Kanal. Stellen Sie PMT HV = 70, Offset = 0, Laserintensität = 10 ein. Stellen Sie die Scangeschwindigkeit auf 1 Bild pro 4 s ein, indem Sie auf die 1/2-Schaltfläche klicken. Stellen Sie die Lochgröße auf 1,2 AE ein, indem Sie auf die Schaltfläche 1,2 AU klicken. Um die Kerngrenze und die Intensität der Kernfärbung abzubilden, überprüfen Sie den Cy5-Kanal. Stellen Sie PMT HV = 70, Offset = 0, Laserintensität = 10 ein. Die Lochgröße ist für die 3D-YAP-Bildgebung optimiert. Klicken Sie nicht erneut auf die Taste 1.2 A.U., nachdem Sie den Cy5-Kanal überprüft haben. Diese Konfiguration wird in Schritt 5.3.7 verwendet.
    4. Aktivieren Sie DIA bei Bedarf über Elemente . Öffnen Sie SpinView, verwenden Sie ein Hellfeld und passen Sie den Fokus des Objekts an, um ein klares Bild der Zellen zu erhalten. Verwenden Sie ein 10x-Objektiv, um mehrere einzelne Zellen unter drei Bedingungen zu finden: mit einer einzelnen Mikroperle im Inneren, mit mehreren Mikroperlen im Inneren und ohne Mikroperle im Inneren. Wechseln Sie zum 40-fachen Objektiv. Benennen Sie diese Position mit der entsprechenden Positionsnummer.
    5. Öffnen Sie Elemente. Klicken Sie auf magnetic_find. Klicken Sie auf die Schaltfläche Verriegelung entfernen.
    6. Klicken Sie auf Scannen und passen Sie die Z-Position der Fokusebene an. Klicken Sie auf die Schaltflächen oben und unten , um den unteren und oberen Grenzwert für den Z-Stapel der ausgewählten Zellen festzulegen. Beenden Sie den Scanvorgang, indem Sie erneut auf Scannen klicken.
    7. Wechseln Sie zu magnetic_YAP_Nucleus Konfiguration. Legen Sie den Dateinamen auf before_small_force.nd2 fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen mit dem aufgezeichneten Z-Stack.
    8. Wechseln Sie zum rechten Lichtpfad und schalten Sie DIA ein. Öffnen Sie SpinView und klicken Sie auf die Schaltfläche Aufnahme . Drehen Sie in der Zwischenzeit den Knopf des Magnetbewegungsgeräts, um den Magneten bis zu 46 mm über dem Petrischalenboden zu bewegen. Speichern Sie Hellfeld-Bildsequenzen oder Videos. Überprüfen Sie das Video, um zu bestätigen, dass Mikroperlen eine durch Magnetkraft induzierte Verschiebung zeigen.
    9. Wiederholen Sie die Schritte 5.3.5-5.3.7; Legen Sie den Dateinamen auf after_small_force.nd2 fest.
    10. Wechseln Sie zum rechten Lichtpfad und schalten Sie DIA ein. Öffnen Sie anschließend SpinView und klicken Sie auf die Schaltfläche Aufnahme . In der Zwischenzeit drehen Sie den Knopf des Magnetbewegungsgeräts, um den Magneten bis zu 120 mm über den Boden der Petrischale zu bewegen. Speichern Sie Hellfeld-Bildsequenzen oder Videos.
    11. Wiederholen Sie die Schritte 5.3.5-5.3.7 und setzen Sie den Dateinamen auf before_large_force.nd2.
  4. Großkraftapplikation und konfokale Bildgebung
    1. Entfernen Sie den Deckel der Umgebungskammer, damit der Magnet 13 mm über den Boden der Petrischale reicht.
    2. Wechseln Sie zum rechten Lichtpfad und schalten Sie DIA ein. Öffnen Sie SpinView und klicken Sie auf die Schaltfläche Aufnahme . Drehen Sie in der Zwischenzeit den Knopf des Magnetbewegungsgeräts, um den Magneten bis zu 13 mm über den Boden der Petrischale zu bewegen. Speichern Sie Hellfeld-Bildsequenzen oder Videos. Überprüfen Sie das Video, um zu bestätigen, dass Mikroperlen eine durch Magnetkraft induzierte Verschiebung zeigen.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 5.3.5-5.3.7 und setzen Sie den Dateinamen auf after_large_force.nd2.
    4. Wechseln Sie zum rechten Lichtpfad und schalten Sie DIA ein. Öffnen Sie anschließend SpinView und klicken Sie auf die Schaltfläche Aufnahme . In der Zwischenzeit drehen Sie den Knopf des Magnetbewegungsgeräts, um den Magneten bis zu 120 mm über den Boden der Petrischale zu bewegen. Speichern Sie Hellfeld-Bildsequenzen oder Videos.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 5.3.5-5.3.7; Legen Sie den Dateinamen auf retract_large_force.nd2 fest.
    6. Schließen Sie den Deckel der Umgebungskammer.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 5.2 und 5.3 für mehrere Sichtfelder, um bei Bedarf weitere Daten zu erhalten.

6. Bildverarbeitung und Datenanalyse

  1. Quantifizierung des YAP N/C Verhältnisses
    1. Öffnen Sie Fiji ImageJ. Öffnen Sie die in Schritt 5 aufgenommenen ND2-Abbilder.
    2. Klicken Sie auf Analysieren > Messungen einstellen. Prüfbereich, integrierte Dichte, mittlerer Grauwert und Formbeschreibungen.
    3. Verwenden Sie den Cy5-Kanal, um den Kern zu identifizieren. Klicken Sie auf Freihandauswahl , um das Freiauswahlwerkzeug zu verwenden, um den Kern zu skizzieren. Überprüfen Sie auch das automatische Kernmaskenmakro in ImageJ (siehe Materialtabelle).
    4. Klicken Sie im FITC-Kanal auf Analyze > Measure . Der gemessene Wert des Mittelwerts ist die mittlere Kern-YAP-Intensität DN.
    5. Verwenden Sie den Cy5-Kanal, um den Kern zu identifizieren. Verwenden Sie den FITC-Kanal, um die Zelle zu identifizieren. Klicken Sie auf Freihandauswahl , um mit dem Freiauswahlwerkzeug einen Bereich von Interesse innerhalb des Zytoplasmas auszuwählen und die magnetische Mikroperle zu vermeiden. Diese Region von Interesse darf nicht den Kern umfassen.
    6. Klicken Sie im FITC-Kanal auf Analyze > Measure . Der gemessene Wert des Mittelwerts ist die mittlere zytoplasmatische YAP-Intensität DC.
    7. Berechnen Sie das YAP N/C-Verhältnis = D N / DC.
  2. Quantifizierung der Kernform und normalisierten Kernfleckenintensität
    1. Öffnen Sie Fiji ImageJ. Öffnen Sie die in Schritt 5 aufgenommenen ND2-Abbilder.
    2. Klicken Sie auf Analysieren > Messungen festlegen. Prüfbereich, integrierte Dichte, mittlerer Grauwert und Formbeschreibungen.
    3. Verwenden Sie den Cy5-Kanal, um den Kern zu identifizieren. Klicken Sie auf Freihandauswahl , um das Freiauswahlwerkzeug zu verwenden, um den Kern zu skizzieren.
    4. Klicken Sie auf Analyze > Measure in Cy5 channel. Der gemessene Wert des Mittelwerts ist die Intensität der Kernfärbung. Der Messwert von Circ. ist nukleare Zirkularität.
    5. Um die Intensität der Kernfärbung bei verschiedenen Kraftzuständen zu vergleichen, wird die gesamte Intensität der Kernfärbung durch die Intensität der Kernfärbung in "before_small_force.nd2" dividiert, um die normalisierte Kernfleckenintensität zu erzeugen.

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Ergebnisse

Entwurf einer magnetbeweglichen Vorrichtung und Anwendung der Magnetkraft
Um Kraft auf den Kern durch die magnetischen Mikroperlen auszuüben, wurde eine magnetbewegliche Vorrichtung entworfen und gebaut, um die räumliche Position des Magneten zu steuern. Die magnetbewegliche Vorrichtung enthält einen zentralen Rahmen, drei Drehknöpfe und Schienen, um den angebrachten Magneten unabhängig voneinander in x-, y- und z-Richtung mit der räumlichen Auflösung von 1,59 mm pro Zyklus zu bewegen (

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Diskussion

Die Internalisierung magnetischer Mikroperlen (Abschnitt 2.2) ist von entscheidender Bedeutung, da extrazelluläre Mikroperlen keine Kraft direkt auf den Kern ausüben können. Krafteinleitung und Bildgebung (Abschnitt 5.3) sind kritische Schritte in diesem Experiment, und die Kraft, die benötigt wird, um den Kern zu verformen und sinnvolle biologische Konsequenzen zu induzieren, könnte probenabhängig sein. Die Kraftstärke in diesem Experiment (0,8 nN und 1,4 nN) kann weiter erhöht werden, um die nukleare Mechano-Se...

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Offenlegungen

Es gibt keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

Dieses Projekt wird durch das UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), den UFHCC Pilot Award (X. T. und Dr. Dietmar Siemann), den UF Opportunity Seed Fund (X. T.) und das UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang) finanziert. Wir schätzen die intellektuellen Gespräche und die fachliche Unterstützung durch Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (Neurochirurgie), Dr. Tian He (Harvard University), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University), Dr. Jessie L-S Au (Institute of Quantitative Systems Pharmacology), Dr. David Hahn (University of Arizona), und Support-Team von Nikon (Dr. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon und Jon Ekman). Wir sind zutiefst dankbar für die effektive Unterstützung durch alle Mitglieder der Forschungslabors von Tang, Yamaguchi, Sharma, Au, Siemann und Guan sowie alle Mitarbeiter der UF MAE-Abteilung.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05 % TrypsinCorning25-051-CI
25 cm2 flaskCorning156340
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeadsN/AN/A
A1R confocal systemNikon
Carbonyl Iron Powder CMBASF30042253Magnetic microbead
Culture medium (RPMI-1640)Gibco11875093
Desktop ComputerDellwith Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZBTokai HitTIZB
Fetal bovine serum (FBS)Gibco26140
Fiji ImageJNational Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Glass-bottom petri dishMatTekP35G-1.5-14-C
MagnetK&J Magnetics, Inc.D99-N52
Monochrome CameraFLIRBFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements software platformNikonsoftware platform
Nucleus mask ImageJ macrohttps://github.com/KOLIUG/Nuclear mask
NucSpot Live 650Biotium#40082Nuclear stain
Penicillin-streptomycinGibco15140122
Phosphate buffered saline (PBS)Gibco10010023
Ti2-E inverted microscopeNikon
XYZ mover (CAD files)https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover

Referenzen

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