Mikrofluidik-unterstützte selektive Depolarisation axonaler Mitochondrien

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Aussaat und Färbung neuronaler Mitochondrien in mikrofluidischen Kammern. Der fluidische Druckgradient in diesen Kammern ermöglicht die selektive Behandlung von Mitochondrien in Axonen, um ihre Eigenschaften als Reaktion auf pharmakologische Herausforderungen zu analysieren, ohne das Zellkörperkompartiment zu beeinträchtigen.

Zusammenfassung

Mitochondrien sind die Hauptlieferanten von ATP (Adenosintriphosphat) in Neuronen. Mitochondriale Dysfunktion ist ein häufiger Phänotyp bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen. Angesichts der ausgeklügelten Architektur und extremen Länge einiger Axone ist es nicht verwunderlich, dass Mitochondrien in Axonen andere Umgebungen erfahren können als ihre Zellkörper-Gegenstücke. Interessanterweise geht die Dysfunktion der axonalen Mitochondrien oft Auswirkungen auf den Zellkörper voraus. Um axonale mitochondriale Dysfunktion in vitro zu modellieren, ermöglichen mikrofluidische Geräte die Behandlung von axonalen Mitochondrien, ohne die somalen Mitochondrien zu beeinflussen. Der fluidische Druckgradient in diesen Kammern verhindert die Diffusion von Molekülen gegen den Gradienten und ermöglicht so die Analyse der mitochondrialen Eigenschaften als Reaktion auf lokale pharmakologische Herausforderungen innerhalb von Axonen. Das aktuelle Protokoll beschreibt die Aussaat von dissoziierten Hippocampus-Neuronen in mikrofluidischen Geräten, die Färbung mit einem membranpotentialempfindlichen Farbstoff, die Behandlung mit einem mitochondrialen Toxin und die anschließende mikroskopische Analyse. Diese vielseitige Methode zur Untersuchung der axonalen Biologie kann auf viele pharmakologische Störungen und bildgebende Auslesungen angewendet werden und eignet sich für mehrere neuronale Subtypen.

Einleitung

Mitochondrien sind die Hauptlieferanten von ATP (Adenosintriphosphat) in Neuronen. Da die neuronale Gesundheit eng mit der mitochondrialen Funktion verbunden ist, ist es nicht verwunderlich, dass eine dysfunktionale Regulation dieser Organellen mit dem Auftreten verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen, einschließlich der Parkinson-Krankheit¹, in Verbindung gebracht wurde. Darüber hinaus wurde die mitochondriale Intoxikation erfolgreich eingesetzt, um Parkinson-Symptome bei Tieren zu modellieren². Sowohl in Tiermodellen als auch bei menschlichen Krankheiten beginnt der Absterben von Neuronen an....

Protokoll

Alle Tierversuche wurden nach den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften der Regierung von Oberbayern durchgeführt. Die primären Neuronen wurden aus E16.5 C57BL/6 Wildtyp-Mausembryonen beiderlei Geschlechts nach Standardmethoden wie zuvor beschrieben hergestellt⁶.

1. Montage der mikrofluidischen Vorrichtung

1. Beschichten Sie eine Gewebekulturplatte mit sechs Vertiefungen auf dem Glasboden mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml Poly-D-Lysin und 3,4 μg/ml Laminin in PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) (siehe Materialtabelle).
2. Inkubieren Sie die beschichtete P....

Ergebnisse

Primäre Hippocampus-Neuronen wurden 7-8 Tage lang in mikrofluidischen Geräten gezüchtet, bevor die Mitochondrien 25 Minuten lang in beiden Kanälen mit dem membransensitiven Farbstoff (TMRE) angefärbt wurden. Wie in Abbildung 2A gezeigt, ergab dies eine homogene Färbung der Mitochondrien auf beiden Seiten der Mikrorillen, reichte jedoch nicht aus, um die Färbung in die Mitte der Mikrorillen auszugleichen. Bei Zugabe von Antimycin A auf der axonalen Seite behielten die somalen Mitochond.......

Diskussion

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Aussaat und Kultur dissoziierter Hippocampus-Neuronen in einem mikrofluidischen Gerät, um axonale Mitochondrien separat zu behandeln. Der Nutzen dieses Ansatzes mit dem membransensitiven Farbstoff TMRE und dem Komplex-III-Inhibitor Antimycin A (wie zuvor gezeigt⁷) wird hier demonstriert, aber diese Methode kann leicht an andere mitochondriale Farbstoffe oder genetisch kodierte Sensoren mitochondrialer Funktionen angepasst werden, die lokale, m.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well Glass bottom plate	Cellvis	P06.1.5H-N	Silicone device
Antimycin A	Sigma	A8674
B27	Gibco	17504044
EVOS M5000 widefield microscope	Thermofischer Scientific	EVOS M5000	fully integrated digital widefield microscope
Hibernate E	BrainBits	HE500
Inverted spinning disk confocal	Nikon	TI2-E + CSU-W1	With incubator chamber
Laminin	Invitrogen	L2020
Microfluidic devices	XONA microfluidics	RD450
Neurobasal medium	Gibco	21103049
Poly-D-Lysine	Sigma	P2636
TMRE	Sigma	87917