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Summary

Die D-Loop Capture (DLC) und D-Loop Extension (DLE) Assays nutzen das Prinzip der Proximity-Ligation zusammen mit quantitativer PCR, um D-Loop-Bildung, D-Loop-Extension und Produktbildung am Ort eines induzierbaren doppelsträngigen Bruchs in Saccharomyces cerevisiae zu quantifizieren.

Abstract

DNA-Schäden, einschließlich DNA-Doppelstrangbrüche und Interstrang-Vernetzungen, die während der S- und G2-Phasen des Zellzyklus entstehen, können durch homologe Rekombination (HR) repariert werden. Darüber hinaus stellt HR einen wichtigen Mechanismus der Replikationsgabelrettung nach Strömungsabriss oder Zusammenbruch dar. Die Regulierung der vielen reversiblen und irreversiblen Schritte dieses komplexen Weges fördert seine Treue. Die physikalische Analyse der während der HR gebildeten Rekombinationszwischenprodukte ermöglicht die Charakterisierung dieser Kontrollen durch verschiedene Nukleoproteinfaktoren und deren Interaktoren. Obwohl es gut etablierte Methoden gibt, um spezifische Ereignisse und Zwischenprodukte im Rekombinationsweg zu untersuchen, hat sich der Nachweis der Bildung und Ausdehnung der D-Schleife, zwei kritische Schritte in diesem Signalweg, bis vor kurzem als schwierig erwiesen. Hier werden effiziente Methoden zum Nachweis von Schlüsselereignissen im HR-Signalweg beschrieben, nämlich DNA-Doppelstrang-Bruchbildung, D-Loop-Bildung, D-Loop-Extension und die Bildung von Produkten durch bruchinduzierte Replikation (BIR) in Saccharomyces cerevisiae . Diese Assays detektieren ihre relevanten Rekombinationszwischenprodukte und Produkte mit hoher Empfindlichkeit und sind unabhängig von der zellulären Lebensfähigkeit. Die Erkennung von D-Schleifen, D-Schleifenverlängerung und dem BIR-Produkt basiert auf der Proximity-Ligatur. Zusammen ermöglichen diese Assays die Untersuchung der Kinetik von HR auf Populationsebene, um die Funktionen von HR-Proteinen und Regulatoren in signifikanten Schritten des Signalwegs genau zu adressieren.

Introduction

Homologe Rekombination (HR) ist ein High-Fidelity-Mechanismus zur Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs), Interstrang-Vernetzungen und ssDNA-Lücken sowie ein Weg für die DNA-Schadenstoleranz. HR unterscheidet sich von fehleranfälligen Wegen für die Reparatur / Toleranz von DNA-Schäden, wie nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) und Transläsionssynthese, dadurch, dass es eine intakte, homologe Duplex-DNA als Spender verwendet, um das Reparaturereignis zu modellieren. Darüber hinaus sind viele der wichtigsten Zwischenprodukte im HR-Pfad reversibel, was eine exquisite Regulierung der einzelnen Pfadschritte ermöglicht. Während der S-, G2- und M-Phasen des Zellzyklus konkurriert HR mit NHEJ um die Reparatur der zweiseitigen DSBs1. Darüber hinaus ist HR essentiell für die DNA-Replikation für die Reparatur von replikationsassoziierten DNA-Schäden, einschließlich ssDNA-Lücken und einseitigen DSBs, und als Mechanismus des DNA-Läsionsbypasses2.

Ein kritisches Zwischenprodukt im HR-Pfad ist die Verdrängungsschleife oder D-Schleife (Abbildung 1). Nach der Endresektion lädt die zentrale Rekombinase in der Reaktion, Rad51, auf die neu resezierte ssDNA des gebrochenen Moleküls und bildet ein helikales Filament2. Rad51 führt dann eine Homologiesuche durch, um einen geeigneten homologen Spender zu identifizieren, typischerweise die Schwesterchromatide in somatischen Zellen. Die D-Schleife wird gebildet, wenn das Rad51-ssDNA-Filament in eine homologe Duplex-DNA eindringt, was zur Watson-Crick-Basenpaarung des gebrochenen Strangs mit dem komplementären Strang des Donors führt und den gegenüberliegenden Donorstrang verdrängt. Die Verlängerung des 3'-Endes des gebrochenen Strangs durch eine DNA-Polymerase ersetzt die Basen, die während des DNA-Schadensereignisses verloren gegangen sind, und fördert die Auflösung des verlängerten D-Loop-Zwischenprodukts in ein dsDNA-Produkt durch das syntheseabhängige Strangglühen (SDSA), das Doppel-Holliday-Diaphragma (dHJ) oder die Break-induzierten Replikationswege (BIR).

Assays, die die Zwischenprodukte im HR-Signalweg physisch überwachen, ermöglichen die Analyse der genetischen Anforderungen für jeden Schritt (d.h. Signalweganalyse). DSB-Bildung, Endresektion, dHJs, BIR-Replikationsblasen und HR-Produkte werden leicht durch Southern Blotting 3,4,5,6,7 beobachtet. Southern Blotting berichtet jedoch nicht über entstehende und ausgedehnte D-Schleifen, und daher ist eine alternative Methode zur zuverlässigen Messung dieser Gelenkmoleküle erforderlich 4,8,9. Eine weit verbreitete Strategie zur Analyse der entstehenden D-Loop-Bildung ist die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) von Rad51 in Verbindung mit quantitativer PCR (qPCR)10,11. Die Rad51-Assoziation mit dsDNA, gemessen mittels ChIP-qPCR, ist jedoch unabhängig von der Sequenzhomologie und dem Rad51-Akzessorfaktor Rad5410,11. Im Gegensatz dazu hängt ein nennenswertes Signal mit der hier vorgestellten Methode der D-Loop-Analyse, dem sogenannten D-Loop Capture (DLC)-Assay, von der DSB-Bildung, der Sequenzhomologie, Rad51 und den Rad51-Akzessorproteinen Rad52 und Rad548 ab. Die Feststellung, dass die von Saccharomyces cerevisiae Rad51 geförderte D-Loop-Bildung von Rad54 in vivo abhängt, stimmt mit zahlreichen In-vitro-Rekonstitutionsexperimenten überein, die darauf hindeuten, dass Rad54 für die Homologiesuche und D-Loop-Bildung durch knospende Hefe Rad51 8,12,13,14,15 benötigt wird.

Ähnlich problematisch sind aktuelle Ansätze zur Messung der D-Loop-Extension, vor allem mittels semi-quantitativer PCR. Ein typischer PCR-basierter Assay zum Nachweis der D-Loop-Extension amplifiziert eine einzigartige Sequenz, die sich aus der Rekombination zwischen einer Bruchstelle und einem ektopischen Donor und der anschließenden rekombinationsassoziierten DNA-Synthese ergibt, über einen Primer stromaufwärts der Region der Homologie auf dem gebrochenen Strang und einen weiteren Primer stromabwärts der Region der Homologie auf dem Donorstrang. Mit dieser Methode erfordert der Nachweis der rekombinationsassoziierten DNA-Synthese den nicht-essentiellen Pol-δ-Prozessivitätsfaktor Pol3216. Dieser Befund steht im Widerspruch zu der Beobachtung, dass die POL32-Deletion nur einen geringen Einfluss auf die Genkonversion in vivohat 17. Darüber hinaus können diese PCR-basierten Assays die D-Loop-Erweiterung und die BIR-Produktbildung nicht zeitlich auflösen, was darauf hindeutet, dass das Signal von dsDNA-Produkten und nicht von ssDNA-Zwischenprodukten 17,18,19 stammt. Der D-loop Extension (DLE) Assay wurde kürzlich entwickelt, um diese Diskrepanzen zu beheben. Der DLE-Assay quantifiziert die rekombinationsassoziierte DNA-Synthese an einer Stelle ~400 Basenpaare (bp) stromabwärts des anfänglichen 3'-eindringenden Endes9. Bei dieser Methode ist die D-Schleifenverlängerung unabhängig von Pol32 und innerhalb von 4 h nach der DSB-Induktion nachweisbar, während BIR-Produkte zuerst nach 6 h beobachtet werden. In einer kürzlich veröffentlichten Veröffentlichung der Laboratorien Haber und Malkova wurde festgestellt, dass die Verwendung dieser Methode zur Herstellung genomischer DNA ausschließlich zur Erhaltung der ssDNA führt 9,20.

Hier werden die DLC- und DLE-Assays ausführlich beschrieben. Diese Assays beruhen auf der Proximity-Ligatur, um entstehende und ausgedehnte D-Schleifen in S. cerevisiae zu erkennen (Abbildung 2)8,9. BIR-Produkte können mit demselben Assay-System quantifiziert werden. Für beide Assays wird die DSB-Bildung an einer HO-Endonuklease-Schnittstelle am URA3-Locus auf Chromosom (Chr.) V durch die Expression der HO-Endonuklease unter der Kontrolle eines Galaktose-induzierbaren Promotors induziert. Rad51-vermittelte DNA-Stranginvasion führt zur entstehenden D-Schleifenbildung an der Stelle eines ektopischen Spenders, der sich am LYS2-Locus auf Chr. II befindet. Da die rechte Seite des DSB keine Homologie zum Spender aufweist, ist eine Reparatur über SDSA und dHJ-Bildung nicht möglich. Eine anfängliche Reparatur des DSB durch BIR ist möglich, aber die Bildung lebensfähiger Produkte wird durch das Vorhandensein desZentromers 21 gehemmt. Dieses bewusste Design verhindert eine produktive DSB-Reparatur und vermeidet so die Wiederaufnahme des Wachstums durch Zellen mit reparierten THSs, die sonst die Kultur während der Zeitverlaufsanalyse überholen könnten.

Im DLC-Assay bewahrt die psorale Vernetzung der beiden Stränge der Heteroduplex-DNA innerhalb der D-Schleife das Rekombinationszwischenprodukt. Nach der Wiederherstellung der Restriktionsenzymstelle am gebrochenen (resezierten) Strang und der Verdauung ermöglicht die Vernetzung die Ligation der einzigartigen Sequenzen stromaufwärts der homologen gebrochenen und Spender-DNAs. Mit Hilfe der qPCR wird der Gehalt an chimären DNA-Molekülen in jeder Probe quantifiziert. Im DLE-Assay ist keine Vernetzung erforderlich, und die Wiederherstellung und Verdauung der Restriktionsenzymstelle, gefolgt von einer intramolekularen Ligation, verbindet stattdessen das 5'-Ende des gebrochenen Moleküls mit dem neu verlängerten 3'-Ende. Auch hier wird qPCR verwendet, um die relativen Mengen dieses chimären Produkts in jeder Probe zu quantifizieren. In Abwesenheit einer Restriktionsenzymstellenwiederherstellung berichtet der DLE-Assay über die relativen Konzentrationen des BIR-Produkts (dsDNA), das nach der D-Schleifenverlängerung gebildet wird.

Repräsentative Ergebnisse für jeden Assay unter Verwendung eines Wildtypstamms werden gezeigt, und die Leser werden auf Piazza et al.8 und Piazza et al.9 verwiesen, um diese Assays für die Analyse von Rekombinationsmutanten 8,9 zu verwenden. Die Absicht dieses Beitrags ist es, anderen Laboratorien die Übernahme der DLC- und DLE-Assays zu ermöglichen, und Unterstützung für sie ist auf Anfrage erhältlich.

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Protocol

1. Vorwachstum, DSB-Induktion und Probenentnahme

HINWEIS: Die Ergänzung aller Medien mit 0,01% Adenin wird für Ade- Stämme empfohlen.

  1. Die entsprechenden haploiden Stämme (siehe Tabelle 1) auf Hefepeptondextroseadenin (YPDA) ( 1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glucose, 2% Agar, 0,001% Adenin) ausstechen und 2 Tage bei 30 °C wachsen.
  2. Verwenden Sie eine einzelne Kolonie, um 5 ml YPDA in einem 15-ml-Glaskulturröhrchen zu impfen. Kulturen bis zur Sättigung bei 30 °C mit Schütteln oder Drehung zur Belüftung züchten.
  3. DLC-Assay: Bereiten Sie die 5x Psoralen-Stammlösung (0,5 mg / ml Trioxsalen in 200-prozentigem Ethanol) in einem Abzug vor, indem Sie Psoralen in einem 50-ml-konischen Röhrchen, das in Aluminiumfolie eingewickelt ist, über Nacht bei Raumtemperatur mit kontinuierlichem Schütteln oder Inversion auflösen. Versiegeln Sie den Schraubverschluss mit einer transparenten Folie, um Verdunstung zu verhindern. Bereiten Sie nicht mehr als 7 ml 5x Psoralen-Stammlösung pro 50 ml konisches Röhrchen vor, um eine ordnungsgemäße Auflösung des Psoralens zu gewährleisten.
  4. Verwenden Sie am nächsten Tag 5 ml der über Nacht angebauten YPDA-Kultur, um 50-100 ml YEP-Laktat (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% w/w Laktat, 0,001% Adenin) in einem angemessen großen Kolben (knospende Hefe wächst optimal in einem Kolben, der mindestens das 5-fache Volumen der Kultur hat) auf einen OD600 von ~ 0,03 zu impfen.
  5. Die Kultur für ~16 h bei 30 °C mit Schütteln bei 220 U/min wachsen lassen. Nach ~16 h messen Sie den OD600 der Kultur und es sollte ~ 0,5-0,8 sein. Verwenden Sie keine unter- oder überwucherten Kulturen.
  6. Sammeln Sie für jeden Zeitpunkt das entsprechende Zellvolumen in einem konischen Röhrchen und legen Sie es auf Eis. Typischerweise sind dies 1 x 108 Zellen (ca. 7,5 ml Kultur bei OD 600 1,0 für einen haploiden Wildtyp-Stamm) für den DLC-Assay und 5 x 107 Zellen (ca. 2,5 ml Kultur bei OD600 1,0) für den DLE-Assay.
  7. Um die Genauigkeit der OD 600-Werte zu gewährleisten, bereiten Sie 1:5-Verdünnungen für Kulturen mit einem OD600≥0,2 vor, um den OD-Wert bei 0,2 oder darunter zu halten. Für Wildtyp-Stämme liegen die optimalen Zeitpunkte für die DLC-Analyse zwischen 2 h und 6 h und die optimalen Zeitpunkte für die DLE-Analyse zwischen 4 h und 8 h (siehe Abbildung 3 und Abbildung 4).
  8. DLC-Test
    1. Bereiten Sie vor jedem Zeitpunkt ausreichend 1x Psoralenlösung (0,1 mg/ml Trioxsalen, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 20% Ethanol) in einem Abzug für alle Proben in einem 50 ml konischen Röhrchen vor, das in Folie eingewickelt ist. Verlassen Sie bei RT.
    2. Zentrifugieren Sie die Proben bei 2.500 x g für 5 min bei 4 °C. Resuspendieren Sie das Pellet in 2,5 ml 1x Psoralenlösung in einem Abzug und geben Sie es in eine 60 mm x 15 mm große Petrischale. Alternativ kann das Pellet in 2,5 ml TE1-Lösung (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0) für eine nicht vernetzende Kontrolle resuspendiert werden.
    3. Vernetzen Sie die Proben. Für einen UV-Vernetzer mit langwelligen (365 nm) Lampen positionieren Sie die Petrischalen 1-2 cm unter der UV-Lichtquelle, wobei der Deckel auf einer Kunststoff- oder Plexiglasplatte entfernt wird, die bei −20° C vorgekühlt wurde. Für einen UV-Lichtkasten platzieren Sie die Petrischalen direkt auf der UV-Lichtquelle. Belichten Sie die Proben für 10 min mit leichtem Schütteln.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die UV-Lichtquelle auf einem Orbitalschüttler einzustellen, der auf ~ 50 U / min eingestellt ist.
    4. Die Probe wird in einem Abzug in ein neues 15-ml-Röhrchen überführt. Spülen Sie die Petrischale mit 2,5 ml TE1-Lösung aus und geben Sie diese in die Röhre. Zentrifugieren Sie die Proben bei 2.500 x g für 5 min bei 4 °C, entsorgen Sie den Überstand ordnungsgemäß und lagern Sie das Pellet bei −20 ° C. Die Proben können bis zu 1 Woche gelagert werden, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird.
  9. DLE-Assay
    1. Zentrifugieren Sie die Proben bei 2.500 x g für 5 min bei 4 °C. Waschen Sie das Zellpellet in 2,5 ml kalter TE1-Lösung, bevor Sie den Spin wiederholen und die Pellets bei −20 °C lagern. Die Proben können bis zu 1 Woche gelagert werden, bevor sie zum nächsten Schritt übergehen.
  10. Für die Probenentnahme bei 0 h sammeln Sie die Proben vor der Zugabe von 20% Galaktose. Für nachfolgende Zeitpunkte induzieren Sie die DSB-Bildung, indem Sie den Kulturen 20% Galaktose zu einer Endkonzentration von 2% hinzufügen. Sammeln Sie die restlichen Proben wie oben beschrieben, pelletieren und frieren Sie relativ zur Zeit nach der DSB-Induktion ein (d. h. die 4-stündige Probe wird 4 h nach Zugabe von 20% Galaktose entnommen).

2. Zellsphäroplasting, Lyse und Wiederherstellung der Restriktionsstelle

  1. Die Proben auf Eis auftauen. Ein trockenes Bad auf 30 °C vorheizen.
  2. Die Proben werden in 1 mL Sphäroplastierpuffer (0,4 M Sorbitol, 0,4 M KCl, 40 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,2, 0,5 mM MgCl2) resuspendiert und in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
  3. Fügen Sie 3,5 μL Zymolyaselösung hinzu (2% Glucose, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mg/ml Zymolyase 100T; 17,5 μg/ml Zymolyase Endkonzentration). Mischen Sie vorsichtig durch Klopfen oder Inversion. Bei 30 °C 15 min inkubieren und dann auf Eis legen. Während der 15-minütigen Inkubation erhalten Sie flüssigen Stickstoff oder Trockeneis.
  4. 3 min bei 2.500 x g bei 4 °C zentrifugieren und die Proben auf Eis legen. Waschen Sie die Proben 3x in 1 ml Sphäroplastierpuffer. Zentrifugieren Sie die Proben für 3 min bei 2.500 x g bei 4 °C.
  5. Resuspendieren Sie die Proben in 1 ml kaltem 1x Restriktionsenzympuffer (50 mM Kaliumacetat, 20 mM Trisacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 100 μg/ml BSA pH ~8,0 bei RT) und zentrifugieren Sie für 3 min bei 16.000 x g bei 4 °C. Legen Sie die Proben auf Eis. Wiederholen Sie die Wäsche 1x.
  6. Resuspendieren Sie die Proben in 1 ml kaltem 1x Restriktionsenzympuffer. Teilen Sie die Probe (jeweils 0,5 ml) in zwei 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf. Zentrifugieren Sie die Proben für 3 min bei 16.000 x g bei 4 °C.
  7. Resuspendieren Sie ein Röhrchen aus jeder Probe in 180 μL 1,4x Restriktionsenzympuffer mit hybridisierenden Oligos (siehe Tabelle 2) und ein Röhrchen in 180 μL 1,4x Restriktionsenzympuffer ohne hybridisierende Oligos. Jedes hybridisierende Oligo wird in 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) resuspendiert und in einer Endkonzentration von 7 nM verwendet. Der 1x TE ersetzt die hybridisierenden Oligos im 1,4x Restriktionsenzympuffer ohne hybridisierende Oligos.
    HINWEIS: Die hybridisierenden Oligos müssen bei −20 °C in kleinen Aliquoten bei der Arbeitsverdünnung gelagert werden. Die Konzentration der hybridisierenden Oligos kann optimiert werden müssen; siehe Diskussion.
  8. Die Proben werden in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis/Ethanol eingefroren und bei −80 °C gelagert. Proben können in diesem Stadium für mehrere Monate gelagert werden.

3. Restriktionsenzymverdau und intramolekulare Ligation

  1. Die Proben auf Eis auftauen. Ein trockenes Bad auf 65 °C und ein weiteres auf 37 °C vorheizen.
  2. 36 μL der Probe werden in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis geleitet. Die restliche Probe wird umgehend zur Lagerung auf −80 °C zurückgebracht.
  3. Fügen Sie 4 μL 1% SDS (0,1% Endkonzentration) hinzu und mischen Sie, indem Sie vorsichtig auf die Seite des Röhrchens klopfen. Bei 65 °C 15 min mit leichtem Klopfen alle 5 min inkubieren. Legen Sie die Proben unmittelbar nach der Inkubation auf Eis.
    HINWEIS: Diese SDS-Behandlung fördert die Denaturierung von DNA-assoziierten Proteinen, die Solubilisierung der Kernhülle und die Chromatinzugänglichkeit vor dem Restriktionsenzymverdau und den intramolekularen Ligationsschritten.
  4. Fügen Sie 4,5 μL 10% Triton X-100 (1% Endkonzentration) hinzu und mischen Sie durch Pipettieren. Zu jeder Probe 20-50 U Restriktionsenzym (EcoRI-HF oder HindIII-HF) geben und bei 37 °C 1 h unter leichtem Rühren alle 20-30 min inkubieren. Während dieser Zeit ein trockenes Bad auf 55 °C und ein Wasserbad auf 16 °C vorheizen.
  5. Fügen Sie 8,6 μL 10% SDS (1,5% Endkonzentration) zu jeder Probe hinzu und mischen Sie durch Pipettieren und Klopfen. Bei 55 °C 10 min inkubieren. Fügen Sie 80 μL 10% Triton X-100 (6% Endkonzentration) zu jeder Probe hinzu und mischen Sie durch Pipettieren.
  6. 660 μL 1x Ligationspuffer ohne ATP (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT,2,5 μg/mL BSA) + 1 mM ATP pH 8,0 + T4 DNA-Ligase (8 U/Probe) zu jeder Probe zugeben und durch sanfte Inversion mischen. Inkubieren bei 16 °C für 1,5 h mit Inversion alle 30 min. Legen Sie die Proben unmittelbar nach der Inkubation auf Eis.

4. DNA-Reinigung

  1. Ein trockenes Bad auf 65 °C und ein weiteres auf 37 °C vorheizen. Zu jeder Probe (12,5 μg/ml Endkonzentration) 10 mg/ml Proteinase K (hergestellt in 1x TE pH 8,0) zugeben. Bei 65 °C 30 min inkubieren und die Proben unmittelbar nach der Inkubation auf Eis legen, bis sie abgekühlt sind.
  2. Die Proben werden in 2-ml-Röhrchen überführt. In einem Abzug arbeiten und jeder Probe ein gleiches Volumen (~ 800 μL) Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol (p / c / ia; pH 8,0) hinzufügen. Wirbeln Sie die Proben für ~30 s und zentrifugieren Sie die Proben für 5-10 min bei 16.000 x g in einer Mikrozentrifuge.
  3. Entfernen Sie vorsichtig 600 μL der oberen Phase jeder Probe in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. Entsorgen Sie die untere Phase und 2 ml Röhrchen ordnungsgemäß.
  4. Fällung der DNA, indem Sie jeder Probe ein 1/10-Volumen von 3 M Natriumacetat pH 5,2 (~ 60 μL) hinzufügen, gefolgt von 1 Volumen Isopropanol (~ 660 μL). Invertieren Sie die Proben 5x-10x und inkubieren Sie bei RT für 30 min.
  5. Legen Sie die Proben für 2 min auf Eis und zentrifugieren Sie dann die Proben bei 16.500 x g für 15 min bei 4 °C in einer Mikrozentrifuge. Bringen Sie die Proben zu Eis zurück, gießen Sie den Überstand ab und lassen Sie das Röhrchen auf einem Papiertuch abtropfen.
  6. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 200 μL 70% Ethanol. Bei 16.500 x g 3 min bei 4 °C zentrifugieren, die Proben wieder auf Eis legen, den Überstand abgießen und den Restalkohol mit einem Pipet entfernen. Trocknen Sie die Proben mit offenen Kappen der Röhrchen bei 37 °C für 15-20 min.
  7. Resuspendieren Sie die DNA-Pellets in 50 μL 1x TE durch Wirbeln. Bei RT 30 min inkubieren, Wirbel und dann bei 37 °C in einem trockenen Bad 30 min inkubieren. Wirbeln Sie die Proben erneut aus und legen Sie sie dann auf Eis. Die Proben können in diesem Stadium bei −20 °C für mehrere Monate gelagert werden, aber es ist ratsam, sofort mit den Decrosslinking- (nur DLC) und qPCR-Schritten fortzufahren.

5. Psoralen-Crosslink-Umkehrung (nur für DLC-Assay)

  1. Pipet 9 μL gereinigte DNA in ein PCR-Röhrchen auf Eis. 1 μL 1 M KOH (0,1 M Endkonzentration) zugeben. Inkubieren Sie die Proben bei 90 °C für 30 min in einem Thermocycler.
  2. Fügen Sie 19,73 μL Natriumacetatlösung hinzu (0,1 M Natriumacetat, 9,6 mM Tris-HCl pH 8,0, 1,0 mM EDTA pH 8,0). Proben können in diesem Stadium bei −20 °C für mehrere Monate gelagert werden, aber es ist ratsam, sofort mit dem qPCR-Schritt fortzufahren.

6. Quantitative PCR, Kontrollen und Analyse

  1. Unter Verwendung von 2 μL gereinigter DNA, mit oder ohne Vernetzung, wird eine 20 μL qPCR-Reaktion gemäß den Anweisungen des Herstellers eingerichtet. Richten Sie jede Reaktion doppelt ein. Sowohl für den DLC- als auch für den DLE-Assay gibt es fünf Kontrollreaktionen und eine DLC/DLE-Quantifizierungsreaktion oder insgesamt sechs Reaktionen pro Probe, die in doppelter Ausführung durchgeführt werden. Die Zusatztabelle S1 und die Zusatztabelle S2 bieten eine Vorlage für die Einrichtung dieser Reaktionen und Analysen, und die Sequenzen der qPCR-Primer sind in Tabelle 3 aufgeführt.
  2. Die qPCR-Zyklusbedingungen müssen für jedes qPCR-Kit optimiert werden.
    1. Verwenden Sie die folgenden DLC qPCR-Bedingungen, abhängig von den verwendeten qPCR-Kits: anfängliche Denaturierung (95 °C für 3 min); 50 Schuss Verstärkung (95 °C für 15 s, 61 °C für 25 s, 72 °C für 15 s mit einer einzigen Erfassung); Schmelzkurvenanalyse (95 °C für 5 s, 65 °C für 1 min, 97 °C mit kontinuierlicher Erfassung); und Kühlung (37 °C für 30 s).
    2. Verwenden Sie die folgenden qPCR-Bedingungen für den DLE-Assay: anfängliche Denaturierung (95 °C für 5 min); 50 Schuss Verstärkung (95 °C für 15 s, 60 °C für 30 s, 72 °C für 15 s mit einer einzigen Erfassung); Schmelzkurvenanalyse (95 °C für 5 s, 65 °C für 1 min, 97 °C mit kontinuierlicher Erfassung); und Kühlung (37 °C für 30 s). Beachten Sie, dass eine Optimierung für verschiedene qPCR-Maschinen/Kits erforderlich sein kann.
  3. DLC-Test
    1. Kontrollen: Siehe Liste der qPCR-Primer in Tabelle 3. Eine Karte der Primerbindungsstellen ist in Abbildung S1 dargestellt. Ergänzende Sequenzdateien für die relevanten genomischen Merkmale und Amplikone finden Sie in den ApE-Dateien (A plasmid Editor); Ergänzende Sequenzdateien 1-5.
      1. Genomische DNA bei ARG4: Verwenden Sie olWDH1760/olWDH1761, um dsDNA bei ARG4 zu amplifizieren. Verwenden Sie diese Reaktion als Ladesteuerung und normalisieren Sie alle anderen Reaktionen mit Ausnahme der DLC-Signalreaktion auf diese Steuerung.
      2. Intramolekulare Ligationseffizienz bei DAP2: Verwenden Sie das 1.904 bp-Fragment, das durch den EcoR-I-Aufschlusserzeugt wurde, für die intramolekulare Ligation parallel zur DLC-Ligation. Die Amplifikation über diesen Ligationsübergang berichtet über die intramolekulare Ligationseffizienz und dient als Kontrolle, auf die das DLC-Signal normalisiert wird.
      3. DSB-Induktion: Verwenden Sie olWDH1766/olWDH1767, um einen Bereich zu verstärken, der den induzierten DSB überspannt.
      4. Psoralen-Vernetzung und -Resektion: Verwenden Sie olWDH2019/olWDH2020, um die einzigartige PhiX-Region stromabwärts der EcoRI-Erkennungsstelle zu verstärken. Verwenden Sie ohne Crosslink-Umkehrung das Verhältnis der ssDNA (keine Vernetzung) zu ARG4 (vernetzte dsDNA), um die Vernetzungseffizienz zu bestimmen. Bei der Crosslink-Umkehrung führt die Resektion zu einer progressiven Abnahme des Signals von 1 auf 0,5 relativ zu ARG4.
      5. EcoR I-Erkennungsstelle Wiederherstellung und Schnitt: Verwenden Sie olWDH1768/olWDH1764, um einen Bereich zu verstärken, der die restaurierte EcoRI-Erkennungsstelle stromaufwärts des DSB auf dem resezierten Strang überspannt. olWDH1769/olWDH1763 verstärken eine Region, die sich über die EcoRI-Restriktionsenzymstelle bei DAP2 erstreckt. Führen Sie an dieser Stelle eine EcoRI-Spaltung durch, um sie als intramolekulare Ligationskontrolle zu verwenden.
    2. DLC-Signal: Verwenden Sie olWDH1764/olWDH1765, um das chimäre DNA-Molekül zu amplifizieren, das durch intramolekulare Ligation des resezierten (eindringenden) Strangs und des Donors erzeugt wird.
    3. Analyse: Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung der Cp-Werte für jede der doppelten Reaktionen. Verwenden Sie die genomischen ARG4-DNA-qPCR-Cp-Werte als Referenz, um alle anderen Kontroll-qPCRs zu normalisieren. Normalisieren Sie das DLC-Signal zur intramolekularen Ligationskontrolle bei DAP2. Siehe Abbildung 3 für typische DLC-Signalwerte bei 2 h.
  4. DLE-Assay
    1. Kontrollen: Siehe Liste der qPCR-Primer in Tabelle 3. Eine Karte der Primerbindungsstellen ist in Abbildung S1 dargestellt. Ergänzende Sequenzdateien für die relevanten genomischen Merkmale und Amplikone finden Sie in den A-Plasmid-Editor-Dateien (ApE) (Supplementary Sequence Files 1-5).
      1. Genomische DNA bei ARG4: Siehe Abschnitt 6.3.1.1.
      2. Intramolekulare Ligationseffizienz bei YLR050C: Verwenden Sie den HindIII-Aufschluss, um ein 765-bp-Fragment zu erzeugen, das parallel zur DLE-Ligation einer intramolekularen Ligation unterzogen wird. Die Amplifikation über diesen Ligationsübergang berichtet über die intramolekulare Ligationseffizienz und dient als Kontrolle, auf die das DLE-Signal normalisiert wird.
      3. DSB-Induktion: Siehe Abschnitt 6.3.1.3.
      4. Hirschkuh Wiederherstellung und Schneiden der III-Erkennungsstelle: Verwenden Sie olWDH2010/olWDH2012 und olWDH2009/2011, um eine Region zu amplifizieren, die die HindIII-Restriktionsenzymstellen auf dem gebrochenen Strang überspannt, wo sie reseziert bzw. verlängert wurde.
    2. DLE-Signal: Verwenden Sie olWDH2009/olWDH2010, um das chimäre DNA-Molekül zu amplifizieren, das durch intramolekulare Ligation des resezierten Endes des eindringenden Strangs stromaufwärts des DSB zum neu verlängerten Ende stromabwärts des DSB erzeugt wird.
    3. Analyse: Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung der Cp-Werte für jede der doppelten Reaktionen. Verwenden Sie die genomischen ARG4-DNA-qPCR-Cp-Werte als Referenz, um alle anderen Kontroll-qPCRs zu normalisieren. Normalisieren Sie das DLE-Signal zur intramolekularen Ligationskontrolle bei YLR050C. Typische DLE-Signalwerte bei 6 h sind in Abbildung 4 und früheren Publikationen9 dargestellt.

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Results

DLC-Test
Der DLC-Assay erkennt sowohl entstehende als auch ausgedehnte D-Schleifen, die durch die Invasion eines standortspezifischen DSB in einen einzelnen Donor gebildet werden (Abbildung 2). Die Psoralenvernetzung verbindet den gebrochenen Strang und den Spender physikalisch über die heteroduplexe DNA innerhalb der D-Schleife. Die Wiederherstellung der Restriktionsenzymstelle mit einem langen, hybridisierenden Oligo auf dem resezierten Strang des Bruchs ermö...

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Discussion

Die vorgestellten Assays ermöglichen den Nachweis von naszierenden und erweiterten D-Schleifen (DLC-Assay), D-Loop-Erweiterung (DLE-Assay) und BIR-Produktbildung (DLE-Assay ohne hybridisierende Oligonukleotide) mittels Proximity-Ligation und qPCR. Die ChIP-qPCR von Rad51 an vom DSB entfernte Stellen wurde zuvor als Proxy für die Rad51-vermittelte Homologiesuche und D-Schleifenbildung verwendet. Dieses ChIP-qPCR-Signal ist jedoch unabhängig von der Sequenzhomologie zwischen der Bruchstelle und einem potenziellen Donor ...

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

Die Arbeiten im Heyer-Labor werden durch die Bewilligungen GM58015 und GM137751 an W.-D.H. Die Forschung im Piazza-Labor wird vom Europäischen Forschungsrat gefördert (ERC-StG 3D-loop, Grand Agreement 851006). D.R. wird von T32CA108459 und der A.P. Giannini Foundation unterstützt. Wir danken Shih-Hsun Hung (Heyer Lab) für die Weitergabe seiner DLC/DLE-Assay-Ergebnisse und für die zusätzliche Validierung der Änderungen an den Assays, die in diesem Protokoll detailliert beschrieben sind.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection
Equipment
15 and 50 mL conical tubes
15 mL glass culture tubes
250 mL, 500 mL, or 1 L flasks
60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottomSuggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G
Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters
Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver
Rotator
UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shakerSuggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831
Materials
60% w/w sodium DL-lactate syrupSigma-AldrichL1375For media preparation
AgarFisherBP1423500For media preparation
Bacto peptoneBD Difco211840For media preparation
Bacto yeast extractBD Difco212750For media preparation
D-(+)-glucoseBD Difco0155-17-4For media preparation
TrioxsalenSigma-AldrichT6137For psoralen cross-linking
2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration
Supplies
1.5 mL microcentrifuge tubes
Dry bath
Liquid nitrogen or dry ice/ethanol
Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge
Materials
10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0)
Zymolyase 100TUS BiologicalZ1004For spheroplasting
3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation
Supplies
Water bath
Materials
EcoRI-HFNew England BiolabsR3101Restriction enzyme digest for DLC assay
HindIII-HFNew England BiolabsR3104Restriction enzyme digest for DLE assay
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202Intramolecular ligation
4. DNA purification
Supplies
1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes
Materials
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1Sigma-AldrichP2069DNA purification
5. Psoralen cross-link reversal
Supplies
Thermocycler/PCR machine
6. qPCR
Supplies
Lightcycler 480Roche5015278001qPCR machine used by the authors
Lightcycler 96Roche5815916001qPCR machine used by the authors
Materials
LightCycler 480 96-Well Plate, whiteRoche472969200196-well plates for qPCR
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super MixBioRad1725271qPCR kit used by the authors
SYBR Green I Master MixRoche4707516001qPCR kit used by the authors

References

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