Nachweis homologer Rekombinationszwischenprodukte mittels Proximityligation und quantitativer PCR in Saccharomyces cerevisiae

Zusammenfassung

Die D-Loop Capture (DLC) und D-Loop Extension (DLE) Assays nutzen das Prinzip der Proximity-Ligation zusammen mit quantitativer PCR, um D-Loop-Bildung, D-Loop-Extension und Produktbildung am Ort eines induzierbaren doppelsträngigen Bruchs in Saccharomyces cerevisiae zu quantifizieren.

Zusammenfassung

DNA-Schäden, einschließlich DNA-Doppelstrangbrüche und Interstrang-Vernetzungen, die während der S- und G2-Phasen des Zellzyklus entstehen, können durch homologe Rekombination (HR) repariert werden. Darüber hinaus stellt HR einen wichtigen Mechanismus der Replikationsgabelrettung nach Strömungsabriss oder Zusammenbruch dar. Die Regulierung der vielen reversiblen und irreversiblen Schritte dieses komplexen Weges fördert seine Treue. Die physikalische Analyse der während der HR gebildeten Rekombinationszwischenprodukte ermöglicht die Charakterisierung dieser Kontrollen durch verschiedene Nukleoproteinfaktoren und deren Interaktoren. Obwohl es gut etablierte Methoden gibt, um spezifische Ereignisse und Zwischenprodukte im Rekombinationsweg zu untersuchen, hat sich der Nachweis der Bildung und Ausdehnung der D-Schleife, zwei kritische Schritte in diesem Signalweg, bis vor kurzem als schwierig erwiesen. Hier werden effiziente Methoden zum Nachweis von Schlüsselereignissen im HR-Signalweg beschrieben, nämlich DNA-Doppelstrang-Bruchbildung, D-Loop-Bildung, D-Loop-Extension und die Bildung von Produkten durch bruchinduzierte Replikation (BIR) in Saccharomyces cerevisiae . Diese Assays detektieren ihre relevanten Rekombinationszwischenprodukte und Produkte mit hoher Empfindlichkeit und sind unabhängig von der zellulären Lebensfähigkeit. Die Erkennung von D-Schleifen, D-Schleifenverlängerung und dem BIR-Produkt basiert auf der Proximity-Ligatur. Zusammen ermöglichen diese Assays die Untersuchung der Kinetik von HR auf Populationsebene, um die Funktionen von HR-Proteinen und Regulatoren in signifikanten Schritten des Signalwegs genau zu adressieren.

Einleitung

Homologe Rekombination (HR) ist ein High-Fidelity-Mechanismus zur Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs), Interstrang-Vernetzungen und ssDNA-Lücken sowie ein Weg für die DNA-Schadenstoleranz. HR unterscheidet sich von fehleranfälligen Wegen für die Reparatur / Toleranz von DNA-Schäden, wie nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) und Transläsionssynthese, dadurch, dass es eine intakte, homologe Duplex-DNA als Spender verwendet, um das Reparaturereignis zu modellieren. Darüber hinaus sind viele der wichtigsten Zwischenprodukte im HR-Pfad reversibel, was eine exquisite Regulierung der einzelnen Pfadschritte ermöglicht. Während der S-, G2- und M-Phasen des Zellzyklus ko....

Protokoll

1. Vorwachstum, DSB-Induktion und Probenentnahme

HINWEIS: Die Ergänzung aller Medien mit 0,01% Adenin wird für Ade- Stämme empfohlen.

1. Die entsprechenden haploiden Stämme (siehe Tabelle 1) auf Hefepeptondextroseadenin (YPDA) ( 1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glucose, 2% Agar, 0,001% Adenin) ausstechen und 2 Tage bei 30 °C wachsen.
2. Verwenden Sie eine einzelne Kolonie, um 5 ml YPDA in einem 15-ml-Glaskulturröhrchen zu impfen. Kulturen bis zur Sättigung bei 30 °C mit Schütteln oder Drehung zur Belüftung züchten.
3. DLC-Assay: Bereiten Sie die 5x Psoralen-Stammlösung (0,5 mg / ml Trioxsa....

Ergebnisse

DLC-Test
Der DLC-Assay erkennt sowohl entstehende als auch ausgedehnte D-Schleifen, die durch die Invasion eines standortspezifischen DSB in einen einzelnen Donor gebildet werden (Abbildung 2). Die Psoralenvernetzung verbindet den gebrochenen Strang und den Spender physikalisch über die heteroduplexe DNA innerhalb der D-Schleife. Die Wiederherstellung der Restriktionsenzymstelle mit einem langen, hybridisierenden Oligo auf dem resezierten Strang des Bruchs ermö.......

Diskussion

Die vorgestellten Assays ermöglichen den Nachweis von naszierenden und erweiterten D-Schleifen (DLC-Assay), D-Loop-Erweiterung (DLE-Assay) und BIR-Produktbildung (DLE-Assay ohne hybridisierende Oligonukleotide) mittels Proximity-Ligation und qPCR. Die ChIP-qPCR von Rad51 an vom DSB entfernte Stellen wurde zuvor als Proxy für die Rad51-vermittelte Homologiesuche und D-Schleifenbildung verwendet. Dieses ChIP-qPCR-Signal ist jedoch unabhängig von der Sequenzhomologie zwischen der Bruchstelle und einem potenziellen Donor .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection
Equipment
15 and 50 mL conical tubes
15 mL glass culture tubes
250 mL, 500 mL, or 1 L flasks
60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom			Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G
Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters
Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver
Rotator
UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker			Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831
Materials
60% w/w sodium DL-lactate syrup	Sigma-Aldrich	L1375	For media preparation
Agar	Fisher	BP1423500	For media preparation
Bacto peptone	BD Difco	211840	For media preparation
Bacto yeast extract	BD Difco	212750	For media preparation
D-(+)-glucose	BD Difco	0155-17-4	For media preparation
Trioxsalen	Sigma-Aldrich	T6137	For psoralen cross-linking
2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration
Supplies
1.5 mL microcentrifuge tubes
Dry bath
Liquid nitrogen or dry ice/ethanol
Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge
Materials
10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0)
Zymolyase 100T	US Biological	Z1004	For spheroplasting
3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation
Supplies
Water bath
Materials
EcoRI-HF	New England Biolabs	R3101	Restriction enzyme digest for DLC assay
HindIII-HF	New England Biolabs	R3104	Restriction enzyme digest for DLE assay
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202	Intramolecular ligation
4. DNA purification
Supplies
1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes
Materials
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1	Sigma-Aldrich	P2069	DNA purification
5. Psoralen cross-link reversal
Supplies
Thermocycler/PCR machine
6. qPCR
Supplies
Lightcycler 480	Roche	5015278001	qPCR machine used by the authors
Lightcycler 96	Roche	5815916001	qPCR machine used by the authors
Materials
LightCycler 480 96-Well Plate, white	Roche	4729692001	96-well plates for qPCR
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix	BioRad	1725271	qPCR kit used by the authors
SYBR Green I Master Mix	Roche	4707516001	qPCR kit used by the authors