Experimentelle Quantifizierung von Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffabgabesystemen und Zellen in vitro: Ein Leitfaden für die präklinische Bewertung der Nanomedizin

Zusammenfassung

Es wird ein Workflow für die absolute Quantifizierung von Wirkstoffträger-Zell-Interaktionen mittels Durchflusszytometrie demonstriert, um eine bessere rationale Bewertung neuartiger Wirkstoffabgabesysteme zu ermöglichen. Dieser Workflow gilt für Arzneimittelträger aller Art.

Zusammenfassung

Eine wichtige Komponente bei der Entwicklung von Medikamentenabgabesystemen betrifft die Verstärkung oder Abschwächung von Interaktionen mit bestimmten Zelltypen. Zum Beispiel könnte ein Chemotherapeutikum mit einem Antikörper funktionalisiert werden, um die Bindung an Krebszellen zu verbessern ("Targeting") oder mit Polyethylenglykol funktionalisiert werden, um die Immunzellerkennung zu umgehen ("Stealth"). Selbst auf zellulärer Ebene ist die Optimierung der Bindung und Aufnahme eines Wirkstoffträgers ein komplexes biologisches Designproblem. Daher ist es wertvoll zu trennen, wie stark ein neuer Träger mit einer Zelle interagiert, von der funktionellen Wirksamkeit der Fracht eines Trägers, sobald er an diese Zelle geliefert wurde.

Um das chemotherapeutische Beispiel fortzusetzen, "wie gut es an eine Krebszelle bindet" ist ein separates Problem von "wie gut es eine Krebszelle tötet". Quantitative In-vitro-Assays für letztere sind gut etabliert und beruhen in der Regel auf der Messung der Lebensfähigkeit. Die meisten veröffentlichten Forschungsergebnisse zu Zellträgerinteraktionen sind jedoch qualitativ oder semiquantitativ. Im Allgemeinen beruhen diese Messungen auf fluoreszierender Markierung des Trägers und berichten folglich über Wechselwirkungen mit Zellen in relativen oder beliebigen Einheiten. Diese Arbeit kann jedoch standardisiert und mit einer kleinen Anzahl von Charakterisierungsexperimenten absolut quantitativ gemacht werden. Eine solche absolute Quantifizierung ist wertvoll, da sie rationale, klassen- und klasseninterne Vergleiche verschiedener Wirkstoffabgabesysteme ermöglicht - Nanopartikel, Mikropartikel, Viren, Antikörper-Wirkstoff-Konjugate, technisch hergestellte therapeutische Zellen oder extrazelluläre Vesikel.

Darüber hinaus ist die Quantifizierung Voraussetzung für nachfolgende Metaanalysen oder In-silico-Modellierungsansätze . In diesem Artikel werden Videoanleitungen sowie ein Entscheidungsbaum für das Erreichen einer In-vitro-Quantifizierung für Trägerarzneimittelabgabesysteme vorgestellt, die Unterschiede in der Trägergröße und der Kennzeichnungsmodalität berücksichtigen. Darüber hinaus werden weitere Überlegungen zur quantitativen Bewertung fortgeschrittener Wirkstoffabgabesysteme diskutiert. Dies soll als wertvolle Ressource dienen, um die rationale Bewertung und das Design für die nächste Generation von Medikamenten zu verbessern.

Einleitung

Das Design von Medikamentenabgabekonstrukten, die je nach Zelltyp ein spezifisches, entworfenes Verhalten aufweisen, hat erhebliches Forschungsinteresse geweckt. Potenzielle Wirkstoffabgabekonstrukte oder "Träger" umfassen Lipidformulierungen, nanogewachsene anorganische Substanzen, polymere Anordnungen, extrazelluläre Vesikel, funktionalisierte Bakterienzellen oder modifizierte Viren. Alle diese können Organ-, Gewebe- oder Zellspezifität aufgrund physikalischer Eigenschaften, Oberflächeneigenschaften oder technischer chemischer Funktionalisierungen wie Antikörperbindung ^1,2 aufweisen.

Protokoll

1. Auswahl des passenden Streams

1. Befolgen Sie die in Abbildung 1 dargestellte Entscheidungsstruktur, um den besten Workflow (Stream) (Abbildung 2) für den verwendeten Versuchsaufbau zu ermitteln. Weitere Kommentare zu dieser Stream-Auswahl finden Sie in der Diskussion.
2. Wenn Sie dem Zytometer-Stream folgen, fahren Sie mit den Schritten 2.1.1-2.2.7 fort. Wenn Sie dem Massenstream folgen, fahren Sie mit den Schritten 3.1.1.1-3.1.5.7 fort.

Ergebnisse

Wie bereits erwähnt, erfordern verschiedene Wirkstoffträgertypen die Verwendung unterschiedlicher Techniken zur absoluten Quantifizierung der Zellträgerassoziation. Zum Beispiel sind 633 nm disulfidstabilisierte Poly(methacrylsäure) (_{PMA SH)} Kernschalenpartikel groß und dicht genug für die Detektion mit einem empfindlichen Durchflusszytometer. Als solche wurden diese Partikel fluoreszierend markiert, dann mit Seitenwinkellichtstreuung (SALS, analog zu SSC) sowie dem entsprechenden Fluoreszenzkanal angegu.......

Diskussion

Die Charakterisierung der Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffträgern und Zellen gewinnt bei der Entwicklung neuartiger Wirkstoffabgabesysteme zunehmend an Bedeutung. Insbesondere um die rationale Bewertung und den Vergleich verschiedener Trägerkonstrukte zu ermöglichen, ist die absolute Quantifizierung der Leistung des Trägers bei der Interaktion mit Ziel- und Off-Target-Zellen von entscheidender Bedeutung. Dieses Protokoll beschreibt eine Zwei-Stream-Methodik, die es jedem Forscher, der mit einem Wirkstoffträger ar.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide	Invitrogen	A20347	pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies
Apogee A50 Microflow	Apogee		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting
CytoFLEX S Flow Cytometer	Beckman Coulter		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments
FCS Express	De Novo Software		Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python
Infinite 200 PRO	Tecan Lifesciences		Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Biosciences		Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment
NanoSight NS300	Malvern Panalytical		Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis
Prism 8	GraphPad		Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others
Quantum MESF kits Alexa Fluor 647	Bangs Laboratories	647	Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard