Einstufige CRISPR-basierte Strategie zur endogenen Genmarkierung in Drosophila melanogaster

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein vereinfachtes endogenes Gen-Tagging-Protokoll für Drosophila vor, das eine PCR-basierte Technik zur markerfreien Identifizierung erfolgreicher genetischer Veränderungen verwendet und die Entwicklung stabiler Knock-in-Linien erleichtert.

Zusammenfassung

Die Untersuchung der subzellulären Lokalisierung, Dynamik und Regulation von Proteinen in lebenden Zellen hat sich durch das Aufkommen von Techniken, die die Markierung endogener Gene zur Herstellung fluoreszierender Fusionsproteine ermöglichen, grundlegend verändert. Diese Methoden ermöglichen es Forschern, das Verhalten von Proteinen in Echtzeit zu visualisieren und wertvolle Einblicke in ihre Funktionen und Wechselwirkungen in der zellulären Umgebung zu erhalten. Viele aktuelle Genmarkierungsstudien verwenden einen zweistufigen Prozess, bei dem sichtbare Marker, wie z. B. Veränderungen der Augenfarbe, verwendet werden, um genetisch veränderte Organismen im ersten Schritt zu identifizieren, und der sichtbare Marker im zweiten Schritt herausgeschnitten wird. Hier stellen wir ein einstufiges Protokoll zur präzisen und schnellen endogenen Genmarkierung in Drosophila melanogaster vor, das ein Screening auf manipulierte Linien ohne sichtbaren Augenmarker ermöglicht und einen erheblichen Vorteil gegenüber früheren Methoden bietet. Um nach erfolgreichen Gen-Tagging-Ereignissen zu suchen, verwenden wir eine PCR-basierte Technik, um einzelne Fliegen zu genotypisieren, indem wir ein kleines Segment ihres Mittelbeins analysieren. Fliegen, die die Screening-Kriterien bestehen, werden dann verwendet, um stabile Bestände zu produzieren. Hier beschreiben wir das Design und den Bau von CRISPR-Editing-Plasmiden und Methoden zum Screening und zur Bestätigung von technischen Linien. Zusammen verbessert dieses Protokoll die Effizienz der endogenen Genmarkierung in Drosophila erheblich und ermöglicht die Untersuchung zellulärer Prozesse in vivo.

Einleitung

Fluoreszierende Proteine haben sich als leistungsfähige Werkzeuge zur Visualisierung von Proteinlokalisierung, Dynamik und Protein-Protein-Wechselwirkungen in Zellen in lebenden Organismen erwiesen ^1,2. Die Markierung endogener Gene mit fluoreszierenden Proteinen ermöglicht die Langzeit-Live-Bildgebung zellulärer Prozesse mit subzellulärer Auflösung. Darüber hinaus haben diese endogenen Genmarkierungstechniken mehrere Vorteile gegenüber Überexpressions- und Immunfärbeansätzen. Beispielsweise kann eine Überexpression von Proteinen zu Proteinfehlfaltung, unspezifischen Protein-Protein-Wechselwirkungen und Fehllo....

Protokoll

1. Design und Bau von Gen-Editing-Reagenzien

HINWEIS: Um eine endogene Markierung durchzuführen, ist es wichtig, die verschiedenen Isoformen des gewünschten Gens zu identifizieren. Abhängig von den spezifischen Zielen des Experiments kann ein Fluoreszenztag entweder intern oder an den N- oder C-Termini der ausgewählten Proteinisoform(en) eingebaut werden. Für eine optimale CRISPR-vermittelte Editierung ist es entscheidend, die beiden sgRNAs in geeigneter Nähe der vorgesehenen Knock-in-Stelle zu positionieren. Um anschließend eine Editierung durch homologe Rekombination zu ermöglichen, sollte ein Donorvektor hergestellt werden, der Sequenzen u....

Ergebnisse

In unseren Experimenten fanden wir typischerweise eine Erfolgsrate von ~20%-30% beim Screening auf verschiedene endogene markierte Gene auf allen Chromosomen (X, II, III). Die Effizienz dieses Prozesses kann von mehreren Faktoren abhängen, wie z. B. der gRNA-Auswahl, der Art des Gens und der Injektionsqualität. Hier veranschaulichen wir die Ergebnisse unserer Strategie, das endogene Periodengen mit dem mNeonGreen Fluorophor¹³ zu markieren. Das Period.......

Diskussion

Die Ergebnisse zeigen eine schlanke, einfache, einstufige CRISPR-basierte Strategie zur Markierung endogener Gene in Drosophila. In dem Protokoll verwenden wir zwei gRNAs, um DNA-Doppelstrangbruch und homologe Rekombination effizienter zu induzieren. Die gRNAs und das Spenderplasmid werden in Fruchtfliegenembryonen injiziert, die in ihrer Keimbahn das Cas9-Enzym exprimieren. Diese Embryonen werden anschließend unter Standardbedingungen bis zum Erwachsenenalter kultiviert, dann werden sie mit Balancierfliegen ge.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA pH8.0	Invitrogen	AM9260G
5-alpha Competent E. coli (High Efficiency)	NEB	C2987H
96-well deep well plate	BRAND	701354
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500
BbsI-HF	NEB	R3539S
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
D-Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
EcoRI-HF	NEB	R3101S
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A142-212
Prolong Glass Antifade Mounting Medium	Invitrogen	P36982
Proteinase K	QIAGEN	19131
Schneider's Drosophila Medium	Gibco	21720001
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-500
T4 DNA ligase	NEB	M0202S
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
XbaI	NEB	R0145S