Ex vivo Expansion und genetische Manipulation von hämatopoetischen Stammzellen der Maus in Kulturen auf Polyvinylalkoholbasis

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Initiierung, Aufrechterhaltung und Analyse hämatopoetischer Stammzellkulturen der Maus unter Verwendung von ex vivo Polyvinylalkohol-basierter Expansion sowie Methoden zur genetischen Manipulation dieser Zellen durch lentivirale Transduktion und Elektroporation vorgestellt.

Zusammenfassung

Selbsterneuernde multipotente hämatopoetische Stammzellen (HSZ) sind aufgrund ihrer Fähigkeit, die Hämatopoese ein Leben lang zu unterstützen und das gesamte Blutsystem nach einer Transplantation zu rekonstituieren, ein wichtiger Zelltyp. HSZ werden klinisch in Stammzelltransplantationstherapien eingesetzt, die eine kurative Behandlung für eine Reihe von Blutkrankheiten darstellen. Es besteht ein großes Interesse sowohl am Verständnis der Mechanismen, die die HSZ-Aktivität und Hämatopoese regulieren, als auch an der Entwicklung neuer HSZ-basierter Therapien. Die stabile Kultivierung und Expansion von HSCs ex vivo war jedoch ein großes Hindernis bei der Untersuchung dieser Stammzellen in einem handhabbaren ex vivo System. Wir haben kürzlich ein auf Polyvinylalkohol basierendes Kultursystem entwickelt, das die langfristige und großflächige Expansion von transplantierbaren Maus-HSCs und Methoden zu deren genetischer Editierung unterstützen kann. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Kultivierung und genetischen Manipulation von Maus-HSCs durch Elektroporation und lentivirale Transduktion. Es wird erwartet, dass dieses Protokoll für ein breites Spektrum von experimentellen Hämatologen nützlich sein wird, die sich für HSZ-Biologie und Hämatopoese interessieren.

Einleitung

Das hämatopoetische System unterstützt eine Reihe essentieller Prozesse bei Säugetieren, von der Sauerstoffversorgung über die Bekämpfung von Krankheitserregern bis hin zu spezialisierten Blut- und Immunzelltypen. Eine kontinuierliche Blutproduktion (Hämatopoese) ist erforderlich, um die Homöostase des Blutsystems zu unterstützen, die von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) aufrechterhalten ^wird1. Die primitivste hämatopoetische Zelle ist die hämatopoetische Stammzelle (HSC), die über einzigartige Fähigkeiten zur Selbsterneuerung und Multilineage-Differenzierung verfügt ^2,3. Dabei handelt es sich um eine seltene Zellpopulation, die vor allem im adulten Knochenmark⁴ vorkommt, wo sie mit einer Häufigkeit von nur etwa einer von 30.000 Zellen vorkommt. Es wird angenommen, dass HSZ die lebenslange Hämatopoese unterstützen und helfen, die Hämatopoese nach hämatologischem Stress wiederherzustellen. Diese Kapazitäten ermöglichen es HSZ auch, das gesamte hämatopoetische System nach der Transplantation in einen bestrahlten Empfänger stabil zu rekonstituieren⁵. Dies stellt die funktionelle Definition einer HSZ dar und bildet auch die wissenschaftliche Grundlage für die HSZ-Transplantationstherapie, eine kurative Behandlung einer Reihe von Blut- und Immunerkrankungen⁶. Aus diesen Gründen sind HSZ ein wichtiger Schwerpunkt der experimentellen Hämatologie.

Trotz eines großen Forschungsschwerpunkts ist es nach wie vor eine Herausforderung, HSCs ex vivo stabil zu erweitern ⁷. Vor kurzem haben wir das erste langfristige ex vivo Expansionskultursystem für Maus-HSCs⁸ entwickelt. Der Ansatz kann transplantierbare HSZ über eine 4-wöchige Kultur um das 234- bis 899-fache erweitern. Im Vergleich zu alternativen Ansätzen bestand die wesentliche Änderung des Protokolls darin, dass Serumalbumin entfernt und durch ein synthetisches Polymer ersetzt wurde. Polyvinylalkohol (PVA) wurde als optimales Polymer für die HSC-Kulturen^{der Maus identifiziert 8}, das nun auch zur Kultivierung anderer hämatopoetischer Zelltypen⁹ verwendet wurde. Kürzlich wurde jedoch auch ein anderes Polymer namens Soluplus (ein Polyvinylcaprolactam-acetat-Polyethylenglykol-Pfropfcopolymer) identifiziert, das die klonale HSC-Expansion zu verbessern^{scheint 10}. Vor der Verwendung von Polymeren wurde Serumalbumin in Form von fötalem Kälberserum, Rinderserumalbuminfraktion V oder rekombinantem Serumalbumin verwendet, die jedoch nur eine begrenzte Unterstützung für die HSC-Expansion boten und nur eine kurzfristige (~1 Woche) ex vivo Kultur unterstützten⁷. Es sollte jedoch beachtet werden, dass HSC-Kulturprotokolle, die HSCs in einem Ruhezustand halten, eine längere ex vivo Kulturzeit unterstützen können^11,12.

Im Vergleich zu anderen Kulturmethoden ist ein großer Vorteil von PVA-basierten Kulturen die Anzahl der Zellen, die erzeugt werden können, und die Zeitspanne, in der das Protokoll verwendet werden kann, um HSZ ex vivo zu verfolgen. Dies überwindet mehrere Barrieren auf dem Gebiet der experimentellen Hämatologie, wie z.B. die geringe Anzahl von HSCs, die pro Maus isoliert werden können (nur einige Tausend) und die Schwierigkeit, HSCs über die Zeit in vivo zu verfolgen. Es ist jedoch wichtig, sich daran zu erinnern, dass diese Kulturen die HSC-Proliferation stimulieren, während der In-vivo-HSC-Pool in einem stationären Zustand überwiegend ruht¹³. Obwohl die Kulturen selektiv für HSCs sind, reichern sich im Laufe der Zeit zusätzliche Zelltypen mit den Kulturen an, und transplantierbare HSCs machen nach 1 Monat nur etwa eine von 34 Zellen aus. Myeloische hämatopoetische Vorläuferzellen scheinen der wichtigste kontaminierende Zelltyp in diesen HSC-Kulturen zu sein⁸. Nichtsdestotrotz können wir diese Kulturen zur Anreicherung für HSCs aus heterogenen Zellpopulationen (z.B. c-Kit⁺ Knochenmark-HSPCs¹⁴) verwenden. Es unterstützt auch die Transduktion oder Elektroporation von HSCs für die genetische Manipulation^14,15,16. Um die Identifizierung von HSCs aus der heterogen kultivierten HSPC-Population zu erleichtern, wurde CD201 (EPCR) kürzlich als nützlicher ex vivo HSC-Marker^10,17,18 identifiziert^, wobei transplantierbare HSCs auf die CD201+CD150+c-Kit⁺Sca1⁺Lineage^- Fraktion beschränkt sind.

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Initiierung, Aufrechterhaltung und Bewertung von PVA-basierten HSC-Expansionskulturen der Maus sowie Protokolle zur genetischen Manipulation innerhalb dieser Kulturen mittels Elektroporation oder lentiviraler Vektortransduktion. Es wird erwartet, dass diese Methoden für eine Reihe von experimentellen Hämatologen nützlich sein werden.

Protokoll

Alle Tierverfahren, einschließlich Zucht und Euthanasie, müssen innerhalb der institutionellen und nationalen Richtlinien durchgeführt werden. Die unten aufgeführten Experimente wurden vom britischen Innenministerium genehmigt. In der Materialtabelle finden Sie eine Liste aller Materialien, Reagenzien und Geräte, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Vorbereiten von Bestandslösungen

1. PVA-Lagerlösung
   1. Nehmen Sie 50 ml Wasser in Gewebekulturqualität in eine kleine Glasflasche (zum Autoklavieren geeignet). Erwärmen Sie das Wasser in der Mikrowelle fast zum Kochen.
   2. 5 g PVA-Pulver abwiegen und in das Wasser geben.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, nur 1-5 g PVA aufzulösen. Das Auflösen größerer Mengen kann zu einer unvollständigen Rekonstitution führen.
   3. Schließen Sie den Deckel fest und schütteln Sie ihn, um ihn zu mischen. Lösen Sie dann den Deckel.
      Anmerkungen: Seien Sie beim erneuten Öffnen vorsichtig, da sich der Druck aufgrund der sich ändernden Wassertemperatur ändern kann.
   4. Autoklavieren und abkühlen lassen. Schließen Sie den Deckel fest und schütteln Sie ihn, um ihn zu mischen. Aliquots in sterilen Röhrchen herstellen und bis zu 3 Monate bei 4 °C lagern.
2. Lösen Sie lyophilisierte Zytokine in F-12-Medium auf, das 1 mg/ml PVA enthält. Rekonstituieren Sie den Stammzellfaktor auf 10 μg/ml und Thrombopoietin auf 100 μg/ml, um 1:1.000 Vorräte zu erzeugen. Aliquots in sterilen Röhrchen herstellen und langfristig bei -80 °C lagern. Alternativ können die Aliquots bei 4 °C bis zu 1 Woche gelagert werden.
   HINWEIS: Vermeiden Sie die Rekonstitution von Zytokinen im Rinderserumalbumin aufgrund des negativen Einflusses auf die HSZ-Expansion der Maus.

2. HSC-Knochenmarkentnahme und c-Kit⁺ Anreicherung

1. Sezieren Sie die Oberschenkelknochen, Schienbeine, Becken und Wirbelsäule von frisch eingeschläferten 8-12 Wochen alten C57BL/6-Mäusen (durch CO₂ -Erstickung und/oder zervikale Luxation) und legen Sie die Knochen in PBS auf Eis.
   Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass die Oberflächen und Werkzeuge mit 70 % Ethanol sterilisiert sind.
2. Reinigen Sie die Knochen mit fusselfreien, empfindlichen Arbeitstüchern, entfernen Sie Muskeln und Rückenmark und geben Sie sie mit ~ 3 ml PBS in einen Mörser.
   Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass der Stößel und der Mörser mit 70% Ethanol sterilisiert und dann einmal mit PBS ausgewaschen werden.
3. Zerkleinern Sie die Knochen mit dem Stößel, ohne zu mahlen, um die Scherkräfte zu minimieren. Brechen Sie große Knochenmarkfragmente, die in das PBS freigesetzt werden, mit einer 19-G-Nadel auf, die an einer 5-ml-Spritze befestigt ist. Überführen Sie die Zellsuspension durch einen 70-μm-Filter in ein konisches 50-ml-Röhrchen.
4. Sobald die Suspension übertragen wurde, wiederholen Sie den Vorgang mit frischem PBS, bis die Knochen gebleicht sind und kein Knochenmark mehr sichtbar ist. Streben Sie ein Endvolumen von ~30 ml pro Maus und ~50 ml für zwei Mäuse an.
5. Mischen Sie die Knochenmarkszellen, sammeln Sie 10 μl Zellen und zählen Sie mit Türks-Lösung in einer Verdünnung von 1:10-1:20 mit einem Hämozytometer.
   HINWEIS: Es wird erwartet, dass eine Maus 2-5 × 10⁸ ganze Knochenmarkzellen liefert.
6. Schleudern Sie bei 450 × g für 5 min bei 4 °C, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in kaltem PBS (350 μl für eine Maus oder 500 μl für zwei Mäuse).
7. Fügen Sie 0,2 μl Allophycocyanin (APC) Anti-c-Kit-Antikörper pro 10 Millionen Zellen hinzu und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang im Dunkeln bei 4 °C.
8. Geben Sie 5 ml kaltes PBS zu den inkubierten Zellen, um überschüssige Antikörper abzuwaschen, und filtern Sie sie durch einen 50-μm-Filter in ein frisches konisches 15-ml-Röhrchen.
9. Waschen Sie das Originalröhrchen mit 7 ml kaltem PBS und füllen Sie es durch den Filter. Wenn der Filter verstopft ist, kratzen Sie die Filteroberfläche mit einer P1000-Spitze.
10. Schleudern Sie bei 450 × g für 5 min bei 4 °C, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in kaltem PBS (350 μl für eine Maus oder 500 μl für zwei Mäuse).
11. Fügen Sie 0,2 μl Anti-APC-Mikrokügelchen pro 10 Millionen Zellen hinzu und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang im Dunkeln bei 4 °C. Fügen Sie 12 ml steriles PBS hinzu, um überschüssige Mikrokügelchen abzuwaschen.
12. Die Zellen werden bei 450 × g für 5 min bei 4 °C heruntergeschleudert und in 2 ml kaltem PBS resuspendiert. Während sich die Zellen in diesem Schritt drehen, fahren Sie mit Schritt 2.13 fort.
13. Bereiten Sie sich auf die Säulenanreicherung vor, indem Sie eine magnetische Filtrationssäule in den Magneten eines magnetischen Säulenseparators einsetzen, mit einem 50-μm-Filter oben und einem konischen 15-ml-Röhrchen unten.
14. Lassen Sie 3 ml steriles PBS durch den 50-μm-Filter und die Filtrationssäule laufen. Sobald das PBS durchlaufen ist, führen Sie die Zellsuspension durch die Säule, gefolgt von drei Waschgängen mit jeweils 3 ml kaltem PBS. Warten Sie bei jeder Wäsche, bis die Säule aufgehört hat zu tropfen, bevor Sie die nächste Wäsche hinzufügen.
15. Entfernen Sie die Säule vom Magneten und legen Sie sie auf ein frisches 15-ml-Röhrchen. Fügen Sie 5 ml kaltes PBS hinzu, setzen Sie den Säulenkolben auf die Säule und eluieren Sie die Zellen, indem Sie den Kolben drücken.
16. Mischen Sie die mit c-Kit angereicherten Zellen, sammeln Sie 10 μl Zellen und zählen Sie mit Türks-Lösung in einer Verdünnung von 1:2 mit einem Hämozytometer. Die typische Ausbeute einer Maus beträgt 2-5 × 10⁶ c-Kit⁺ Zellen.
    HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Zellen direkt in HSC-Medien eingesät oder für die HSC-Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) vorbereitet werden.

3. Initiierung von Zellkulturen mit c-Kit-angereicherten HSPCs

1. Bereiten Sie frisches Medium (Tabelle 1) für die erforderliche Anzahl von Zellen/Vertiefungen vor. Samenbildung von 0,5 bis 1 Million Zellen pro ml für c-Kit-angereicherte HSPCs.
2. Die mit c-Kit angereicherten Zellen werden heruntergedreht und in HSC-Medium mit der gewünschten Zelldichte resuspendiert.
3. Übertragen Sie die Zellen auf Fibronektin-beschichtete oder negativ oberflächengeladene Platten mit 200 μl pro 96-Well-Platte oder 1 ml pro 24-Well-Platte.
4. Legen Sie die Zellen in einen Gewebekultur-Inkubator, der auf 37 °C und 5 % CO_{2 eingestellt ist}.

4. Initiierung von Zellkulturen mit FACS-gereinigten HSCs

1. Bereiten Sie ein geeignetes Volumen der biotinylierten Antikörperfärbung vor: 3 μl Mastermix (Tabelle 2) pro 10 Millionen Zellen, verdünnt 1:100 in PBS.
2. Die mit c-Kit angereicherten Zellen werden heruntergedreht und 30 Minuten lang bei 4 °C in der Linienantikörperfärbung resuspendiert.
3. Mit 10 ml sterilem PBS waschen und bei 450 × g 5 min bei 4 °C schleudern.
4. Bereiten Sie ein geeignetes Volumen der frischen HSC-Antikörperfärbung vor (Tabelle 3): 300 μl pro 10 Millionen Zellen. Bereiten Sie neben dieser Probenfärbung geeignete Färbekontrollproben für die Kompensation und das Gating vor.
   Anmerkungen: Arbeiten Sie in einer Gewebekulturhaube bei ausgeschaltetem Licht, wenn Sie farbstoffkonjugierte Antikörper verwenden.
5. Resuspendieren Sie die Zellen in der HSC-Antikörperfärbung und inkubieren Sie sie bei 4 °C für 90 min. Mischen Sie die Zellen alle 20-30 Minuten durch Klopfen, um eine Zellpelletierung zu verhindern.
6. Mit 10 ml sterilem PBS waschen und bei 450 × g 5 min bei 4 °C schleudern.
7. Saugen Sie den Überstand an, schnippen Sie das Pellet, um es zu unterbrechen, und resuspendieren Sie es in sterilem PBS mit 0,5 μg/ml Propidiumiodid (PI).
8. Bereiten Sie frisches Medium (Tabelle 1) für die erforderliche Anzahl von Wells vor und plattieren Sie in Fibronektin- oder negativ oberflächengeladene Platten (200 μl pro 96-Well-Platte oder 1 ml pro 24-Well-Platte).
9. Bereiten Sie die FACS-Maschine für die Sortierung vor und sortieren Sie CD150+CD34-c-Kit⁺Sca1⁺Lineage-HSCs direkt in medienhaltige Vertiefungen (siehe Abbildung 1 für die hier verwendete Standard-FACS-Anschnittstrategie). Sortieren Sie bis zu 200 Zellen pro 96-Well-Plattenvertiefung oder bis zu 1.000 Zellen pro 24-Well-Well.
   HINWEIS: FACS-Maschinen sollten von einem geschulten Wissenschaftler bedient werden. Es wird empfohlen, dass sich Benutzer an ihre örtliche FACS-Einrichtung wenden, um diese Sortierstrategie zu besprechen, wenn sie keine Erfahrung mit der FACS-Isolierung von Maus-HSCs haben.

5. Medienwechsel durchführen

1. Bei Zellkulturen, die aus c-Kit-angereicherten Zellen initiiert wurden, beginnt der Medienwechsel nach 2 Tagen. Bei Zellkulturen, die aus FACS-isolierten HSCs initiiert wurden, beginnt der Medienwechsel nach 5 Tagen.
2. Bereiten Sie für alle Vertiefungen ausreichend frisches, vorgewärmtes (~37 °C) HSC-Medium (Tabelle 1) vor.
3. Nehmen Sie die Platte vorsichtig aus dem Gewebekultur-Inkubator.
   HINWEIS: Da HSPCs auf negativ oberflächengeladenen Platten leichter gestört werden als solche auf Fibronektin, sollte beim Wechsel des Mediums auf negativ oberflächengeladenen Platten besondere Vorsicht walten lassen, um eine Störung der Zellkulturen zu vermeiden.
4. Entfernen Sie mit einer Pipette oder Vakuumpumpe langsam ~90%-95% des Mediums aus dem Brunnenmeniskus.
   Anmerkungen: Vermeiden Sie es, das Medium vom Boden der Vertiefung aufzuziehen, da sonst viele Zellen entfernt werden.
5. Geben Sie 200 μl (für 96-Well-Platten; 1 ml für 24-Well-Platten) frisches Medium in die Well.
6. Setzen Sie die Platte wieder in den Inkubator für Gewebekulturen ein.
7. Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.6 alle 2-3 Tage bis zum experimentellen Endpunkt.
8. Bei Zellkulturen, die mit c-Kit-angereicherten HSPCs (Abschnitt 3) initiiert wurden, werden die Kulturen nach ~3 Wochen im Verhältnis 1:2-1:3 aufgeteilt. Bei Zellkulturen, die mit FACS-gereinigten HSCs (Abschnitt 4) initiiert wurden, teilen Sie die Kulturen im Verhältnis 1:2-1:3 nach ~3 Wochen und wenn die Kulturen zu >90% konfluent sind.
   HINWEIS: Der genaue Zeitplan hängt von den experimentellen Interessen ab. Diese Kulturen wurden für 4-8^Wochen charakterisiert 8, aber es können auch zusätzliche Kulturlängen möglich sein.

6. Elektropolieren von kultivierten HSPCs

HINWEIS: Dieses Protokoll ist für die Elektroporation von Cas9/sgRNA-Ribonukleoprotein (RNP) vorgesehen, könnte aber auch für die Elektroporation von mRNA oder anderen rekombinanten Proteinen angepasst werden. Initiieren Sie Kulturen mit einer ausreichenden Anzahl von Zellen, um dies zum gewünschten experimentellen Zeitpunkt durchzuführen.

1. Führen Sie 1 Tag vor der Elektroporation einen Mediumwechsel durch, wie in Abschnitt 5 beschrieben.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, vor der Elektroporation mindestens eine Kultur über Nacht zu erhalten. Die Zellen werden jedoch in der Regel 1-3 Wochen lang kultiviert, bevor sie transduziert werden.
2. Stellen Sie am Tag der Elektroporation den Nukleofektor auf. Schalten Sie das Gerät ein. Wählen Sie auf dem Touchscreen das X-Modul und dann die verwendete Küvettengröße aus.
3. Bereiten Sie eine ausreichende P3-Lösung (gemäß den Anweisungen des Herstellers) für den Maßstab der Elektroporation vor (100 μl pro Küvette oder 20 μl pro Mikroküvette) und lassen Sie sie auf Raumtemperatur ausgleichen.
4. Bereiten Sie ausreichend frisches Medium (Tabelle 1) für die Anzahl der zu plattierenden Wells vor und fügen Sie 500 μl Medium für eine 24-Well-Plattenvertiefung oder 100 μl Medium für eine 96-Well-Plattenvertiefung hinzu.
5. Die sgRNA (vorverdünnt auf 2 μg/ml in RNase-freiem Wasser) auf Eis auftauen und 16 μg sgRNA mit 30 μg Cas9-Enzym (bei 10 μg/ml) in einem sterilen PCR-Röhrchen mischen. Fügen Sie ein zusätzliches PCR-Röhrchen hinzu, das nur Cas9-Protein als Kontrolle enthält. Mischen Sie, indem Sie die Röhre schnippen und dann kurz nach unten drehen. Bei 25 °C für 10 min in einem Thermocycler inkubieren, um das RNP zu komplexieren, und dann die Röhrchen auf Eis halten.
   HINWEIS: Dies kann verfünffacht werden, wenn die Elektroporation in Mikroküvetten durchgeführt wird.
6. Mischen und überführen Sie die HSPCs für die Elektroporation in ein Röhrchen; Sammeln Sie 10 μL der Zellen und zählen Sie mit Türks-Lösung in einer Verdünnung von 1:2 mit einem Hämozytometer.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, 1-5 Millionen Zellen pro 100-μl-Küvette zu elektroporieren (für die Mikroküvette fünffach herunterskaliert).
7. Die entsprechenden Zahlenzellen werden in einem 1,5-ml-Röhrchen bei 450 × g für 5 min bei 4 °C heruntergeschleudert. Saugen Sie so viel wie möglich vom Überstand ab und resuspendieren Sie ihn mit 100 μl Nukleofektionspuffer.
8. Übertragen Sie die Zellsuspension sofort in das PCR-Röhrchen mit dem komplexierten RNP und pipettieren Sie langsam auf und ab, um sie vorsichtig zu mischen und in eine 100-μl-Elektroporationsküvette zu überführen. Werfen Sie das Gemisch langsam und in einer flüssigen Bewegung in die Küvette aus, um die Bildung von Luftblasen in der Küvette zu vermeiden.
9. Wählen Sie am Elektroporator die Position der zu elektroporierenden Wells aus. Wählen Sie über den Touchscreen das Zelltypprogramm CD34⁺, Mensch oder geben Sie den Impulscode EO100 ein. Drücken Sie die OK-Taste.
10. Übertragen Sie die Küvetten in den Elektroporator. Drücken Sie die Start-Taste auf dem Touchscreen, um die Elektroporation zu starten. Direkt nach der Elektroporation werden 500 μl des Nährmediums in die Küvette gegeben (100 μl bei Verwendung einer Mikroküvette).
11. Übertragen Sie die Zellen vorsichtig auf die vorbereitete Platte und kehren Sie in den Gewebekultur-Inkubator zurück.
12. Bei Verfahren, bei denen eine AAV6-Spenderschablone verwendet wird, wird der Vektor sofort nach dem Transfer der Zellen auf eine mit Fibronektin beschichtete Platte in einer Konzentration von 5.000 Vektoren/Zelle hinzugefügt.
13. Bereiten Sie nach 6-18 Stunden frisches Medium vor und führen Sie einen Mediumwechsel durch, wie in Abschnitt 5 beschrieben. Entfernen Sie für diesen Medienwechsel nur 80%-90% des Mediums.
    Anmerkungen: Vermeiden Sie es, das Medium vom Boden der Vertiefung aufzuziehen.
14. Analysieren Sie die Zellen nach 2 oder mehr Tagen mittels Durchflusszytometrie (siehe Abschnitt 8 für Details).
15. Führen Sie weiterhin alle 2 Tage einen Medienwechsel durch, wie in Abschnitt 5 beschrieben, bis der experimentelle Endpunkt erreicht ist.
    HINWEIS: Die Editierungsraten von CRISPR/Cas9 mit dieser Methode hängen stark von der Targeting-Effizienz der entworfenen sgRNA ab. Bearbeitungsraten von bis zu 95 % wurden mit einem effizienten Leitfaden^{beobachtet 15}. Richtlinien für das sgRNA-Design wurden bereits an anderer Stelle ausführlich beschrieben^19,20.

7. Transduzieren von kultivierten HSPCs mit lentiviralem Vektor

HINWEIS: Initiieren Sie Kulturen mit einer ausreichenden Anzahl von Zellen, um dies zum gewünschten experimentellen Zeitpunkt durchzuführen.

1. Generierung und Titer lentiviraler Vektoren (abhängig von den experimentellen Zielen). Lentiviralen Vektor auf Eis auftauen.
2. Führen Sie einen Medienwechsel durch (wie in Abschnitt 5 beschrieben). Mischen Sie dann die HSPCs für die Transduktion und übertragen Sie sie in ein Röhrchen. Sammeln Sie 10 μl der Zellen und zählen Sie mit Türks-Lösung in einer Verdünnung von 1:2 mit einem Hämozytometer.
   Anmerkungen: Die Zellen können sofort nach dem Galvanisieren transduziert werden. Die Zellen werden jedoch in der Regel 1-3 Wochen lang kultiviert, bevor sie transduziert werden.
3. Die erforderliche Dosis von Zellen für die Transduktion wird neu plattiert (in der Regel 100.000 Zellen pro 96-Well-Platte). Separat werden nicht transduzierte Negativkontrollzellen geblendet.
   HINWEIS: Wenn Sie negative oberflächengeladene Platten verwenden, übertragen Sie die Zellen auf Fibronektin-beschichtete Platten für die lentivirale Vektortransduktion.
4. Fügen Sie jedem Zelltopf einen lentiviralen Vektor hinzu: Fügen Sie 20 Transduktionseinheiten pro Zelle hinzu, um eine Transduktionseffizienz von ~30 % zu erreichen. Die lentivirale Vektordosis ist jedoch empirisch zu bestimmen, abhängig von den experimentellen Anforderungen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der lentivirale Vektor gemäß den institutionellen Richtlinien entsorgt wird.
5. Bringen Sie die Zellen für 6 h in den Inkubator für Gewebekulturen zurück. Führen Sie anschließend einen Medienwechsel durch, wie in Abschnitt 5 beschrieben.
   HINWEIS: Der Überstand enthält lebende Viren. Entsorgen Sie gemäß den institutionellen Richtlinien.
6. Analysieren Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie (z. B. auf GFP-Expression) nach 2 Tagen oder mehr. Weitere Informationen finden Sie in Abschnitt 8.
7. Führen Sie weiterhin alle 2 Tage einen Medienwechsel durch, wie in Abschnitt 5 beschrieben, bis der experimentelle Endpunkt erreicht ist.

8. Durchflusszytometrische Analyse von HSPC-Kulturen

1. Es wird eine konzentrierte kultivierte ex vivo HSC-Antikörpermischung in PBS hergestellt, die 2 % FBS enthält (Tabelle 4). Lagern Sie die Mischung bei 4 °C im Dunkeln bis zu 1 Monat.
   Anmerkungen: Arbeiten Sie in einer Gewebekulturhaube bei ausgeschaltetem Licht, wenn Sie farbstoffkonjugierte Antikörper verwenden.
2. Fügen Sie 2 μl konzentrierte Antikörpermischung zu 50 μl Zellen hinzu. 30 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren. Bereiten Sie neben dieser Probenfärbung geeignete Färbekontrollproben für die Kompensation und das Gating vor.
3. Fügen Sie 200-1.000 μl PBS mit 2% FBS hinzu und zentrifugieren Sie bei 450 × g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich und resuspendieren Sie 100-500 μl PBS mit 2 % FBS und 0,5 μg/ml PI.
4. Richten Sie das Durchflusszytometer ein und erfassen Sie mindestens 10.000 lebende Zellen pro Probe.
   HINWEIS: Durchflusszytometer sollten von einem geschulten Wissenschaftler bedient werden. Benutzer müssen sich an ihre örtliche FACS-Einrichtung wenden, um diese Analyse zu besprechen, wenn sie keine Erfahrung in der Durchflusszytometrie haben.
5. Exportieren Sie die Daten im FCS-Format und analysieren Sie die Daten mit einer geeigneten Durchflusszytometrie-Analysesoftware. In Abbildung 2 finden Sie die hier verwendete Standard-Gating-Strategie.

Ergebnisse

Für die FACS-Aufreinigung von HSCs erwarten wir, dass innerhalb des c-Kit-angereicherten Knochenmarks ~0,2% der Zellen die CD150+CD34-c-Kit⁺Sca1^{+Lineage-Population} für junge (^8-12 Wochen alte) C57BL/6-Mäuse sind (Abbildung 1). Es ist jedoch wahrscheinlich, dass transgene Mäuse oder Mäuse unterschiedlichen Alters unterschiedliche HSZ-Frequenzen aufweisen. Nach 4 Wochen Kultur erwarten wir, dass der CD201+CD150+c-Kit⁺Sca1

Diskussion

Wir hoffen, dass dieses Protokoll einen nützlichen Ansatz zur Untersuchung der HSZ-Biologie, Hämatopoese und Hämatologie im Allgemeinen bietet. Seit der Erstentwicklung der PVA-basierten Kulturmethode für FACS-gereinigte HSCs⁸ wurde die Methode erweitert. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass die Methode mit c-Kit, angereichert mit Knochenmark, und mit negativ oberflächengeladenen Platten¹⁴ funktioniert. Seine Kompatibilität mit Transduktion und Elektroporation wurde eb...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dissection kit	Fisher Scientific	12764416
Hemocytometer	Appleton Woods Ltd	HC002
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit	Lonza	V4XP-3024
Pestle and mortar	Scientific Laboratory Supplies Limited	X18000
QuadroMACS separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
Materials
5 mL syringe	VWR International Ltd	720-2519
19 G needle	VWR International Ltd	613-5394
50 μm cell strainer	Sysmex	04-004-2317
70 μm cell strainer	Corning	431751
Kimtech wipes	VWR International Ltd	115-2075
LS MACS column	Miltenyi Biotec	130-042-401
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg	IDT	1081058
Animal free recombinant mouse stem cell factor	Peprotech	AF-250-03
Animal free recombinant mouse thrombopoietin	Peprotech	AF-315-14
Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8)	ThermoFisher	17-1171-83
Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8)	Biolegend	105828
Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34)	Biolegend	135040
Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34)	Biolegend	135006
Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2)	Biolegend	115914
Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560)	ThermoFisher	17-2012-82
Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34)	ThermoFisher	11-0341-85
Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5)	Biolegend	100526
Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5)	Biolegend	100508
Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2)	Biolegend	103224
Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2)	Biolegend	103204
Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1)	Biolegend	103428
Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7)	Biolegend	100704
Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7)	Biolegend	100714
Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5)	Biolegend	108424
Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5)	Biolegend	108404
Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7)	Biolegend	108108
Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119)	Biolegend	116223
Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119)	Biolegend	116204
CellBIND plates, 24-well	Corning	3337	negative surface charged
CellBIND plates, 96-well	Corning	3330	negative surface charged
Custom synthetic sgRNA	Synthego, Sigma Aldrich, IDT	Custom order
Fetal bovine serum	Merck Life Science UK Limited	F7524-50ML
Fibronectin Coated plates, 96-well	BD Biosciences	354409
Ham's F-12 Nutrient Mix	Gibco	11765054
Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x)	Gibco	51500.056
Phosphate buffered saline	Alfa Aesar	J61196.AP
Polyvinyl alcohol	Sigma Aldrich	P8136
Propidium Iodide	Enzo Life Sciences (UK) Ltd	EXB-0018
Streptavidin APC/Cy7	Biolegend	405208
Türks’ solution	Sigma Aldrich	109277
Virkon	Mettler-Toledo Ltd	95015662