Überwachung von Veränderungen in menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen nach Virusinfektion mittels impedanzbasierter Echtzeit-Zellanalyse

Zusammenfassung

Die aktuelle Studie beschreibt ein Protokoll zur Überwachung der Veränderungen in humanen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) während einer Virusinfektion mit Hilfe eines Echtzeit-Zellanalysesystems (RTCA).

Zusammenfassung

Endothelzellen kleiden die innere Oberfläche aller Blut- und Lymphgefäße aus und bilden eine semipermeable Barriere, die den Austausch von Flüssigkeit und gelösten Stoffen zwischen Blut oder Lymphe und dem umgebenden Gewebe reguliert. Die Fähigkeit eines Virus, die Endothelbarriere zu überwinden, ist ein wichtiger Mechanismus, der die Ausbreitung des Virus im menschlichen Körper erleichtert. Es wird berichtet, dass viele Viren die endotheliale Permeabilität verändern und/oder während der Infektion eine Störung der Endothelzellbarriere verursachen, was zu Gefäßleckagen führen kann. Die aktuelle Studie beschreibt ein Echtzeit-Zellanalyseprotokoll (RTCA), bei dem ein kommerzieller Echtzeit-Zellanalysator verwendet wird, um die endotheliale Integrität und Permeabilität während einer Infektion der menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) mit dem Zika-Virus (ZIKV) zu überwachen. Die vor und nach der ZIKV-Infektion aufgezeichneten Impedanzsignale wurden in Zellindexwerte (CI) übersetzt und analysiert. Das RTCA-Protokoll ermöglicht den Nachweis von transienten Effekten in Form von zellmorphologischen Veränderungen während einer Virusinfektion. Dieser Assay könnte auch nützlich sein, um Veränderungen in der vaskulären Integrität von HUVECs in anderen Versuchsanordnungen zu untersuchen.

Einleitung

Endothelzellen (ECs) kleiden die innere Oberfläche aller Blut- und Lymphgefäße aus. Sie sind durch Adhären, enge Gap Junctions, verbunden, die eine semipermeable Barriere zwischen Blut oder Lymphe und dem umgebenden Gewebe bilden ^1,2. Die intakten endothelialen Zell-Zell-Verbindungen sind entscheidend für die Regulierung des Transports von Makromolekülen, gelösten Stoffen und Flüssigkeiten, die für die physiologischen Aktivitäten der entsprechenden Gewebe und Organe entscheidend sind³. Die Endothelbarriere ist dynamisch und wird durch spezifische Stimuli moduliert⁴

Protokoll

1. Vorbereitung der Zellen

1. Vorbereitung von HUVECs
   1. Züchten Sie 7,5 x 10⁵ HUVEC-Zellen/ml in einer 75 cm² (beschichtet mit 20 μg/ml Kollagen Typ 1) Zellkulturflasche, die 12 ml Endothelzellmedium (ECM) enthält, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS), 0,01 % Endothelzellwachstumsergänzung (EKG), die Wachstumsfaktoren, Hormone und Proteine enthält, die für die Kultur von HUVECs erforderlich sind. und 0,01% Penicillin-Streptomycin (P/S). Inkubieren Sie die Zellen in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂ (Abbildung 1).

Ergebnisse

Vor der ZIKV-Infektion lag das CI für die HUVEC-Monoschicht, die auf einer speziellen Gold-Mikroelektroden-beschichteten Mikrotiterplatte kultiviert wurde, über 8, was auf starke Adhärenzeigenschaften hindeutet. Platten oder Vertiefungen mit einem CI-Index von weniger als 8 sollten verworfen werden. Die HUVECs wurden dann mit ZIKV bei einem MOI von 0,1 und 1 infiziert, und die Zellimpedanz wurde 7 Tage lang aufgezeichnet. Der KI-Wert der mit ZIKV P6-740 infizierten HUVECs bei einem MOI von 0,1 (hellblaue Linie) begann.......

Diskussion

Eine zytozide Virusinfektion in permissiven Zellen ist in der Regel mit erheblichen Veränderungen der Zellmorphologie und Biosynthese verbunden³⁶. Die virusinduzierten zellulären morphologischen Veränderungen, wie Zellschrumpfung, Zellvergrößerung und/oder Synzytienbildung, werden auch als zytopathische Effekte (CPEs) bezeichnet, die für bestimmte Virusinfektionen charakteristisch sind³⁷. In ECs wurde das CPE als die Zerstörung von Zellen und den Zusammenbruch der Ti.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Nest	615601
37 °C incubator with 5% CO2	Sanyo	MCO-18AIC
75 cm2 tissue culture flask	Corning	430725U
Antibiotic solution penicillin-streptomycin (P/S)	Sciencell	0503
Biological safety cabinet, Class II	Holten	HB2448
Collagen Type 1	SIgma-Aldrich	C3867
Endothelial cell growth supplement (ECGS)	Sciencell	1052
Endothelial cell medium (ECM)	Sciencell	1001
E-plate 96	Agilent Technologies, Inc.	05232368001
Fetal bovine serum (FBS)	Sciencell	0025
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H9394
Hemocytometer	Laboroptik LTD	Neubauer improved
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)	Sciencell	8000
Inverted microscope	ZEISS	TELAVAL 31
Latitude 3520 Laptop	Dell	-
Multichannel micropipette (10 - 100 µL)	Eppendorf	3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL)	Eppendorf	3125000052
Reagent reservior	Tarsons	T38-524090
RTCA resistor plate 96	Agilent Technologies, Inc.	05232350001
RTCA Software Pro (Version 2.6.1)	Agilent Technologies, Inc.	5454433001
Single channel pipettes (10 - 100 µL)	Eppendorf	3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL)	Eppendorf	3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL)	Eppendorf	3123000055
xCELLigence Real-time cell analyzer SP (Model: W380)	Agilent Technologies, Inc.	00380601030	https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232